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文档简介

1、活性评价实验活性评价实验天然产物实验室天然产物实验室活性评价室活性评价室2012-4-24实验内容实验内容一、一、Western Blot二、二、Real-Time PCRWestern Blot实验器材：实验器材：电泳转膜电源、电泳仪转膜仪、摇电泳转膜电源、电泳仪转膜仪、摇床、红光、暗室、移液枪、辅助玻床、红光、暗室、移液枪、辅助玻璃仪器若干璃仪器若干试剂试剂:(操作过程中介绍操作过程中介绍)1、试剂准备、试剂准备 6、转膜、转膜2、样品收集、样品收集 7、封闭、封闭3、配胶、配胶 8、一抗、二抗孵育、一抗、二抗孵育4、上样、上样 9、洗涤、洗涤5、电泳、电泳 10、发光鉴定、发光鉴定实验步

2、骤：实验步骤：实验结果处理：实验结果处理：14891489565617177 714941494222211116 614991499272751514 41507015070777792921.001.00313128281.001.00656521211.0111.01175759393 扫描胶片成图片文件，扫描胶片成图片文件，BandScan分析条分析条带灰度值，确定蛋白含量变化。带灰度值，确定蛋白含量变化。Real-time PCR实验器材：实验器材：普通普通PCR、Real-time PCR、电脑、电脑、 Real-time PCR配套软件、各移液枪、配套软件、各移液枪、EP管及其他

3、辅助器材管及其他辅助器材试剂：试剂：RNA提取试剂、提取试剂、RNA反转录试剂、反转录试剂、 Real-time PCR试剂试剂实验步骤：实验步骤：1、细胞培养，药物处理、细胞培养，药物处理2、RNA提取提取3、RNA反转录反转录4、 Real-time PCRReal-time PCR体系体系SYBgreen 12.5l上游引物上游引物 0.25l下游引物下游引物 0.25lcDNA 12lH2O 6l（内参及目的基因）（内参及目的基因）例如：例如：Sample 处理前 处理后 Bax(MeanCt) GAPDH(MeanCt) E18161717.41.951.952 - Ct法：法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%Ct（处理后）（处理后）1617.4=1.4 Ct（处理前）（处理前）18171 Ct=Ct（处理后）（处理后）Ct（处理前）（处理前）1.412.4比率比率（处理后（处理后/处理前）处理前）=2Ct2（2.4） = 5.3 所以所以BaxBax基因在处理后表达水平是处理前的基因在处理后表达水平是处理前的5.35.3倍倍相对定量分析相对定量分析2 2 - -CtCt法法F =2 待测组目的基因待测组目的基因平均平均Ct值值待测组内参基因待测组内参基因平均平均Ct值

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