2022益生菌对早产巴马猪生后肺发育的影响（全文）

1、2022益生菌对早产巴马猪生后肺发育的影响（全文）摘要目的探索益生菌干预在早产巴马猪生后肺脏发育中的作用。方法动物实验研究，2020年4月至2021年10月利用已成功建立的30只早产巴马猪模型，将仔猪分为早产组（妊娠104d出生）、足月组（妊娠113d出生）、早产益生菌干预组（妊娠104d出生后第3天开始给予口服益生菌）和足月益生菌干预组（妊娠113d出生后第3天开始给予口服益生菌），分别记录早产组和足月组仔猪出生后即刻、生后4、9、21d以及早产益生菌干预组和足月益生菌干预组仔猪生后9d后的体重并收集肺组织、回肠组织和肠道内容物。通过比较体重、辐射状肺泡计数来评估仔猪发育情况，通过测量回肠绒

2、毛高度评估回肠发育情况，通过菌群16S核糖体RNA分析评估回肠内容物的菌类构成，组间比较采用,检验。结果30只仔猪中雌性16只、雄性14只。早产组和足月组各12只，早产益生菌干预组和足月益生菌干预组各3只。早产组仔猪生后4、9、21d的体重均分别低于足月组生后4、9、21d（507±27）比（694±56）g、（620±35）比（1092±154）g、（1660±210）比（2960±418）g"=2.96、2.99、2.78,均P<0.05,早产组仔猪出生9d的辐射状肺泡计数低于足月组9d的仔猪(4.00±

3、0.29)比(6.11±0.35)个，片4.64,<0.01o早产组和足月组仔猪在生后不同时间点有不同的高丰度回肠菌属，生后4d时分别为大肠杆菌志贺菌属26.63%和肠球菌属30.48%;出生9d时分别为苏黎世杆菌属35.94%和乳杆菌属27.33%;出生21d时分别为大肠杆菌志贺菌属28.02%和乳杆菌属46.29%。早产组9d仔猪的回肠绒毛高度小于足月组9d的彳子猪(297±21)比(411±32)pm,片3.01,P=0.007o早产益生菌干预组和足月益生菌干预组的仔猪体重、辐射状肺泡计数差异均无统计学意义(692±36)比(767±

4、;67)g、(5.44±0.34)比(5.89±0.26)个，1=0.74、1.04,均P>0.05o早产益生菌干预组及足月益生菌干预组的回肠优势菌属均为苏黎世杆菌属，早产益生菌干预组仔猪的回肠绒毛高度大于早产组9d的仔猪(371±13)比(297±21)pm,片3.04,P=0.006,与足月益生菌干预组仔猪和足月组9d仔猪的差异均无统计学意义(371土13)比(338±12)和(411±32)pm,1=1.90、1.15,均P>0.05。结论早产会影响肺发育中的肺泡化进程。早产生后的益生菌干预可能通过改善肠道发育促进肺

5、泡化进程。世界范围内每年有1500万早产儿出生，早产儿的肺脏一般处于囊泡期或小管期，当早产儿出生后，其尚未发育完全的气道被迫通气，增加了支气管肺发育不良(bronchopulmonarydysplasia,BPD)、慢性肺疾病、哮喘等疾病的发病风险。早产一般会与青春期和成人期的肺功能异常相关联。而对于BPD患儿的研究发现，持续性的气道炎症和气道发育受阻可能在BPD的发生发展中发挥作用。但是这些理论内在的机制却尚不完全清楚，在此基础上进行干预手段的开发也有限。近年来，"肠-肺轴”理论的兴起为早产生后肺发育的干预提供了新的研究思路。一些研究发现，肠道微生态失调可能参与了诸多呼吸道相关疾病

6、例如哮喘等的发病，提示通过干预调节肠道微生态，可能对肺疾病发挥作用。为了探讨肠道微生态与早产生后肺发育的相关性，本研究在前期建立的早产猪模型的基础上，添加益生菌对早产猪进行了干预，对肠道微生态在早产生后肺发育中的作用进行了初步的探索。材料和方法一、材料采用动物实验研究，在2020年4月至2021年10月经重庆市畜牧科学院实验动物伦理委员会批准（实验动物伦理审查书编号202101）,按照前期研究成功建立早产模型的方法【7】，选用30只新生巴马仔猪（雌性16只、雄性14只），并经人工饲养生产许可证编号SCXK（渝）2018-0002,使用许可证编号SYXK（渝）2018-0002,控制其病原微生物

7、和寄生虫，检测其血清、抗凝血、咽拭子、鼻腔拭子、直肠拭子等，检测标准符合中国实验动物学会团体标准（T/CALAS33-2017）的无特异性病原体级猪微生物学监测。二、方法1 .分组：以配种日期作为妊娠起始日，将仔猪分为早产组（妊娠104d出生）、足月组（妊娠113d出生）、早产益生菌干预组（妊娠104d出生后第3天开始给予口服益生菌师足月益生菌干预缜妊娠113d出生后第3天开始给予口服益生菌），其中口服的益生菌为复合益生菌粉剂（15mg中含19亿活菌，其中嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊乳杆菌和婴儿双歧杆菌按照活菌数5：5：3：1混合）按照每只仔猪15mg/d进行饲喂。2 .样本采集：早产组和足

8、月组分别在出生后即刻、生后4、9、21d利用急性失血法各处死3只仔猪；早产益生菌干预组和足月益生菌干预组在生后9d处死；采用1%戊巴比妥（2.5|jl/g）腹腔内注射麻醉仔猪，使用4%（体积分数）多聚甲醛溶液灌洗左肺组织后将其放入装有4%多聚甲醛溶液的容器中固定用于制作石蜡切片。暴露腹腔后，分离回肠肠段，取35cm长的回肠肠段，将内容物收集至2ml冻存管中，直接放入液氮中保存，剩余肠道组织浸入4%多聚甲醛溶液中固定用于制作石蜡切片。3 .辐射状肺泡计数：利用组织石蜡包埋和HE染色完成辐射状肺泡计数和回肠绒毛高度分析，比较早产组与足月组仔猪生后即刻、4组生后9d的辐射状肺泡计数来评估早产对仔猪肺

9、泡化进程的影响以及益生菌干预对早产仔猪生后肺泡化进程的影响。4 .肠道微生物菌群和回肠绒毛高度分析：采用十六烷基三甲基漠化钱法对肠道内容物的基因组DNA进行提取，经过建库、高通量16s核糖体RNA测序、运算分类单元聚类和物种注释完成菌群分析，通过菌群分析评估回肠内容物的菌类构成测量和比较4组仔猪生后9d的回肠绒毛长度评估早产生后及益生菌干预后回肠发育情况。三、统计学处理应用SPSS13.0统计学软件和GraphPadPrism6.0软件进行数据处理，符合正态分布的计量资料以工士s表示，组间比较采用"佥验，以双侧0.05为差异有统计学意义。结果一、一般情况30只仔猪中早产组和足月组各1

10、2只，早产益生菌干预组和足月益生菌干预组各3只。二、各组仔猪的体重、辐射状肺泡计数、回肠菌群组成和回肠绒毛高度的比较1.体重：早产组仔猪生后4、9、21d的体重均分别低于足月组生后4、9、21d（均P<0.05，表1）。早产益生菌干预组与足月益生菌干预组仔猪体重差异无统计学意义（692±36）比（767±67）g,1=0.74,P=0.535;足月益生菌干预组和足月组生后9d（1092±154）g的仔猪体重差异无统计学意义”=1.94,P=0.125）。表1早产组和足月组仃落生后不同时间点的体重比较（声£士，）组别出生后即刻生后4d生后9d生后21

11、d早产组493±62507±2762013516601210足月组61s±27694±561092±值I.S42.962.982.78P值0.140O.CMI0.0410.049注：精个时间点样本U为3只2 .辐射状肺泡计数：如表2所示，早产组仔猪出生后即刻及生后9d辐射状肺泡计数均低于足月组仔猪（均<0.001）;早产益生菌干预组和足月益生菌干预组仔猪辐射状肺泡计数差异无统计学意义（5.40±0.34）比（5.90±0.26）个，仁1.04,0.313o表2早产组和足月组仔猪出生后不同时间点的

12、箱时状肺泡计数分析结果的比较（个/±，）组别出生后即刻生后94早产的1.6±0.44.OtO.29足JI组4.1*036.1±035dft4.964.64P假<0.001<0.001注：每个时间点样本H为3只3 .回肠菌群组成：早产组和足月组仔猪在回肠菌群构成上存在较大差异（表3）,在出生后即刻，早产组和足月组的优势菌属均为假单胞菌属；出生4d时，早产组的优势菌属为大肠杆菌志贺菌属，足月组为肠球菌属；出生9d时，早产组的优势菌属为苏黎世杆菌属，足月组为乳杆菌属；出生21d时，早产组的优势菌属为大肠杆菌志贺菌属，足月组为乳杆菌属。早产益生菌干预组和足月益

13、生菌干预组的回肠优势菌属为均为苏黎世杆菌属。表3出工后不同时网点各组仔猪的回肠曲群F度(俣)组男睛营落羯大感任雨志贾南胤曲球商因不动杆菌及需菌属出生后即刻不产鲍2.591.432.7235.960.633.650.3422.911.0223126.44出生后即刎足月组1.751.82Z2359.77037L690.053.700.8513261431生后4d早产组23.830.0226.6311360.191355000.49023.73生后4d足月组1271.8123.603390.9030.480J70.9716.440.4520.42生后gd：产组35.947.180.930.0224.

14、061.1119.1000.70010.96生后9d足月组1.9127.3325.740.052.4524.023.6102.06012.83中产益生丽卜稠组66.040530.650.010.540.1718.9800.09012.99足月益生前干播组.85.670.280.0400.130.142.480001126生后21d早产射27.7322728.02L334.862.600.0203216.900.1115.84生后21d足月组1.1346.291X010X)33.998.601.1006.25020.60注厂为生后9d4 .回肠绒毛高度：早产组仔猪生后9d的回肠绒毛高度小于足月组

15、9d的仔猪(297±21)kt(411±32)pm,f=3.01,P=0.007o早产益生菌干预组仔猪的回肠绒毛高于早产组9d仔猪(371±13)比(297±21)pm"=3.04,P=0.006，与足月益生菌干预组(338±12)pm和足月组9d仔猪(411±32)pm差异均无统计学意义(£=1.90、1.15,均P>0.05)。讨论肺脏作为人类重要脏器之一，在出生后机体与外界的气体交换及免疫应答等方面起到了非常重要的作用。新生儿科医学技术的不断进步使早产儿的存活率大大提高，然而早产儿的肺脏一般处于囊泡期或

16、小管期，通过对早产儿肺功能研究结果的总结,Jordan和McEvoy提出所有的极早产儿都存在肺功能异常。而Agusti和Hogg发现处于第1秒用力呼气量低四分位区段的儿童在年老时会发展成低第1秒用力呼气量的慢性阻塞性肺疾病。早产儿的肺泡化较差，肺发育不成熟，都是导致肺功能改变和BPD等疾病发生的重要原因。因此亟需对影响早产儿肺泡化的因素及干预措施的研究。本研究首先针对早产猪生后肺发育情况进行评估，并利用临床使用的益生菌对早产猪进行了干预。早产猪的体重从生后4d开始低于同期的足月猪，而其肺泡化程度在出生即刻和出生后9d均低于同期的足月仔猪。这些结果提示早产仔猪在机体生长发育及肺泡化进程方面都受到

17、严重影响，这与目前对早产生后机体及肺发育的认知一致。早产益生菌干预组仔猪生后9d的体重及肺泡化程度均与同期足月组仔猪差异无统计学意义，这个结果提示，益生菌干预对于早产仔猪生后受到影响的机体生长发育及肺泡化进程具有改善作用。为了探究益生菌作用的可能原因，对不同组仔猪的回肠菌群进行了分析。早产组仔猪和足月组仔猪在出生及生后不同时间点的回肠菌群构成上存在较大差异，而添加益生菌后，两组的主要菌群都是苏黎世杆菌属。对于回肠生理结构的分析结果发现，早产组生后9d的回肠绒毛高度低于足月组，早产益生菌干预组生后仔猪9d,其回肠绒毛高度与足月组差异无统计学意义。这部分结果提示早产生后回肠发育受阻，回肠菌群结构异

18、常，使用益生菌可以促进回肠绒毛发育，同时改变回肠的肠道菌群结构。回肠作为小肠的重要组成部分，除了和其他小肠肠段（十二指肠、空肠）一起行使消化分解碳水化合物、蛋白质和脂类的作用之外，主要负责维生素Bl2的吸收。除此之外，在回肠末端由淋巴小结聚集形成集合淋巴滤泡，被称为Peyer板，在机体的适应性免疫过程中起到重要作用。因此，益生菌可能通过营养及免疫2个方面促进了早产仔猪生后的肺泡化进程，但该作用是直接还是间接以及其具体机制需要更加深入的研究。苏黎世杆菌属的细菌在2002年被发现，其功能尚不完全清楚，相关研究的结果提示该菌属可能与炎症反应和肠道疾病相关。但对于猪来讲，有研究发现该菌属可以促进仔猪生长，同时通过降低宿主对病原菌的敏感性参与免疫过程。因此，益生菌可能通过改变回肠菌群构成促进早产仔猪生后机体生长发育。本研究存在一定的局限性，首先，样本量较小，在未来研究中需要增加样本量以检验本研究