LI4 IVIS Lumina XR装机培训

1、1In-Vivo Imaging: IVIS Lumina XR IVIS Specialist 许晔许晔 Ph.D2可见光体内成像系统简介IVIS 硬件系统主要组件活体动物成像系统 软件概述荧光及X射线的选择 软件的操作内内 容容3 ScienceWhy Optical In Vivo Imaging?强大的标记技术强大的标记技术 基因的表达引起荧光素酶的生成 发光强度与活细胞数量正相关 多个领域具有典型应用：癌症研究、转基因动物成像追踪传染病等非侵害性非侵害性 无需处死模型动物操作及处理过程简单操作及处理过程简单体内成像系统体内成像系统4可见光的吸收可见光的吸收组织不是透明的组织不是透明的

2、5光在体内的吸收光在体内的吸收荧光素酶的发射光谱与组织内传播荧光素酶的发射光谱与组织内传播6CCDOpticsBioluminescent Source光子在组织内散射式传播，光子在组织内散射式传播，IVIS检测传播到被测物表面的光信号检测传播到被测物表面的光信号光线在体内传播过程中经过多次的散射，在模型动物的体表形成绒毛状的光谱图像 IVIS 可对物体表面弥散状的图像进行成像 ScienceIVIS检测方式检测方式7X X射线与光学成像组合的价值射线与光学成像组合的价值 The Question: 与体表信号相比，信号源来自哪里？ The Problem: 光线在组织中衰减以及散射使得二维光

3、学信号很难实现精确的结构定位。The Solution: 共记录的X射线图像提供了确定的结构学信息，可确定骨骼的结构和软组织器官，并能为光学信号提供更好的结构学定位信息。X射线提供一个确定的解剖学定位信息作为参考射线提供一个确定的解剖学定位信息作为参考8X-rays In100%X-rays Out95%85%50%35% 35%100%90%40%X X射线与可见光射线与可见光Science X射线光量子比可见光携带更多的能量，可以穿透更厚的组织 X射线穿过组织时会被吸收或者散射 能量、密度、厚度以及材料类型会影响X射线的穿透 可见光寻找最短的路径穿过体表，X射线直接穿透 生物发光光源体表的

4、光线9IVIS Lumina XR 硬件硬件专业的体内成像系统高灵敏度 300-900 nm广阔的动力范围Hardware10IVIS Lumina XR成像暗仓成像暗仓CCD相机， -90C制冷可更换的发射滤光片可加热的样品平台f/1 镜头& 光圈避光及射线防护的成像仓HardwareCsI(Tl)闪烁体自动的铝合金过滤片X射线源(40kVp,100mA)钨阳极11Software活体动物成像系统活体动物成像系统 软件软件控制IVIS 系统所有装置的设置 (全电脑控制)提供高级的编目及浏览工具提供定量分析工具友好的界面，装置的设置与相机相似操作简单，多步操作获取图像 12Softwa

5、re Acquisition图像由多层叠加构成图像由多层叠加构成13Software AcquisitionField of ViewABCDLensAperture (f/stop)ShutterCCDEmission Filters视野(FOV) 取决于镜头到样品的距离 采光与快门打开的时间（曝光时间）成正比光圈 (f/stop) 控制采光量数码的像素 binning与CCD相关 - 可进一步增加灵敏度CCD与镜头的设置与标准相机设置相似与镜头的设置与标准相机设置相似14FOV B = 7.5 x 7.5 cmFOV A = 5 x 5 cmFOV C = 10 x 10 cmFOV D

6、= 12.5 x 12.5 cm可见光视野可见光视野(FOV)Software Acquisition15X射线视野射线视野(FOV)FOV B 7.5 x 7.5 cmFOV A5 x 5 cmFOV C 10 x 10 cmSoftware Acquisition16Software Acquisition操作培训操作培训 可见光成像可见光成像 荧光成像 17Software Acquisition可见光成像步骤可见光成像步骤 相机设置相机设置 曝光时间、光圈、BINNING 图像获取图像获取 单一图像、连续图像 图像标记图像标记 定量分析定量分析18设置灵敏度设置灵敏度发光信号水平发光信

7、号水平IVIS CCD相机初始信号范围为 0 到 65535， 类似于数码Counts (216). 调节相机设置，获得600 到60,000 counts的信号水平可调节信号水平的设置包括: 曝光时间 (Exposure time) CCD 分辨率 (Binning) 光圈 (f/stop)仪器经校准功能自动的补偿由于灵敏度设置改变所产生的损失Software19活体动物成像系统控制面板活体动物成像系统控制面板Software Acquisition灵敏度控制部分灵敏度控制部分影响灵敏度影响灵敏度20曝光时间曝光时间 信号水平与曝光时间成正比例关系 缩短曝光时间可提高通量 推荐的最短曝光时间

8、 0.5 secs 延长曝光时间可增加捕获信号 推荐的最长曝光时间 5 mins2 sec f/1 small binning5000 counts peak10 sec f/1 small binning25000 counts peakSoftware Acquisition曝光时间控制部分曝光时间控制部分21f/1f/16Software Acquisition镜头光圈镜头光圈 f/stop f/stop控制CCD接收的光线数量 f/1 为最大光圈 最大的光线采集量Luminescent模式的默认设置f/16 为最小光圈 最佳分辨率 Photograph模式的默认设置光圈控制部分光圈控制

9、部分22像素像素Binning (CCD 分辨率分辨率)Binning指将一组像素分组合成为一个更大的像素点10 seconds f/2Large BinningSoftware AcquisitionLarge Binning = 8高灵敏度高灵敏度/ / 低分辨率低分辨率Medium Binning = 4Small Binning = 2高分辨率高分辨率/ /低灵敏度低灵敏度10 seconds f/2Medium Binning10 seconds f/2Small BinningBinning控制部分23Software AcquisitionLuminescent 和Fluores

10、cent模式具有自动曝光功能自动曝光自动曝光自动曝光设置用户自定义界面24Software Acquisition102030400.05.0 x10-61.0 x10-51.5x10-52.0 x10-5dP/dEd Energy (keV) Unfiltered Al FilterX-ray 发射光谱发射光谱X-ray 剂量剂量 vs 视野视野 (和曝光时间和曝光时间)Binning控制分辨率控制分辨率 Dose (Gray)： ： 致电离辐射被组织吸收的数量 平均剂量： 4.4 mGray/image （10s， FOV C）X-Ray模式参数模式参数 两种能量设置方式两种能量设置方式:

11、Animal: 适用于活体动物成像模式， 调整透进位置用以降低剂量Specimen: 适用于薄的组织样品成像， 通过过滤来增加对比度25Software Acquisition影响灵敏度相机基础设置总结相机基础设置总结灵敏度控制部分26Software Acquisition可见光成像步骤可见光成像步骤 相机设置相机设置 曝光时间、光圈、BINNING 图像获取图像获取 单一图像、连续图像 图像标记图像标记 定量分析定量分析27Software Acquisition图像获取图像获取单一图像单一图像单一图像获取 Overlay功能会自动获取 Photo + Luminescent 图像并叠加2

12、8Software Acquisition图像获取图像获取 连续模式连续模式自动获取不同时间点、不同设置的一系列图像。开始连续的图像获取友好的次序编辑界面29用于引导生物发光或荧光成像模式下的设置成像向导成像向导 （ （Imaging Wizard） ）30Software Acquisition可见光成像步骤可见光成像步骤 相机设置相机设置 曝光时间、光圈、BINNING 图像获取图像获取 单一图像、连续图像 图像标记图像标记 定量分析定量分析31Software Cataloging图像标记图像标记 （Image Labeling）好的标记习惯对于有效浏览数据非常重要32Software

13、Cataloging用户定义的信息预览窗口用于选择一段时间内保持的多个图像打包打开，进行同时的编辑分析图像目录编辑及浏览工具图像目录编辑及浏览工具33Software Acquisition可见光成像步骤可见光成像步骤 相机设置相机设置 曝光时间、光圈、BINNING 图像获取图像获取 单一图像、连续图像 图像标记图像标记 定量分析定量分析34 调色板工具可以调整标尺/透明度等 ROI (Region of interest)工具用来测量表面的强度Software - Analysis定定 量量35Software AnalysisImportant to be consistent with

14、 ROI selectionsROI工具工具（Regions of Interest）ROI 可选形状:轮廓（Contour）圆圈（Circle）方形（Square）格子（Grid）ROI建立方式: 手动式 （Manually） 自动式 （Automatically） 自由选取 （Free Draw）36Software - Analysis测量列表测量列表 测量列表展示了每个ROI区域图像的信息 用户可对测量列表进行配置，可将列表内容作为电子表格输出37Software - Analysis校准的物理单位校准的物理单位活体动物成像系统 可对仪器的设置进行自动补偿：曝光时间、光圈、Binnin

15、g以及成像视野校准后的单位为光子数/秒， 全方位的描述了用户定义区域连续改变状态的光亮值38Software - Analysis原始信号原始信号(Counts)Peak Counts16008001200400Example： ： 校准后的物理单位校准后的物理单位 vs 原始信号原始信号 Time: 30 sec 30 sec 60 sec 60 sec 60 sec 60 sec Binning: small small small small medium medium Day Number: 1 2 3 4 5 639Software - Analysis校准后的信号校准后的信号(Ph

16、otons per second)Radiance: Photons per secondExample： ： 校准后的物理单位校准后的物理单位 vs 原始信号原始信号 Time: 30 sec 30 sec 60 sec 60 sec 60 sec 60 sec Binning: small small small small medium medium Day Number: 1 2 3 4 5 640Software AnalysisX射线单位射线单位 相对吸收校正相对吸收校正活体动物成像系统活体动物成像系统自动对自动对X射线设置进行补偿射线设置进行补偿: 一体化的曝光时间、光圈、Bin

17、ning及视野X射线的吸收校正可以提高对比度和密度的相互关系0.05.0 x1031.0 x1041.5x1042.0 x104 Instrument Settings Raw AbsorptionCounts将同一小鼠骨组织在不同视野、binning、光圈和曝光时间的条件下成像，统计获得的强度的平均值。不同成像条件下原始图像的数据各不相同，而通过校准后的图像展示了几乎一致的数据。原始图像- Iraw吸收图像- Iabs41Software Acquisition操作培训操作培训 可见光成像可见光成像 荧光成像荧光成像 42荧荧 光光荧光团基态激发波长发射波长激发态Fluorescence43

18、Fluorescence全电脑控制发射滤光片转轮(用户可更换) 12位激发滤光片转轮极低的自发荧光光学和光纤150W 钨/卤素光源，电脑控制强度 IVIS Lumina XR荧光部件荧光部件44荧光滤光片荧光滤光片Filter1234567891043046550053557060564067571074530nm Bandwidth spaced every 35nmTransmission %发发射射滤滤光片光片选择选择标配滤光片500 系列600 系列700 系列 4 个个标标配激配激发滤发滤光片光片 515-875nm 7 个窄个窄带宽发带宽发射射滤滤光片光片 500nm-620nm

19、光光谱谱分离和二分离和二维维光光谱谱成像成像 7 个窄个窄带宽发带宽发射射滤滤光片光片 720nm-840nm 光光谱谱分离分离 NIR成像的最佳配置成像的最佳配置 7 个窄个窄带宽发带宽发射射滤滤光片光片 580nm-700nm 光光谱谱分离和二分离和二维维光光谱谱成像成像10 10 个个标标配激配激发滤发滤光片光片45标配用滤光片可于多种指示剂成像标配用滤光片可于多种指示剂成像4 个个标标配的配的发发射射滤滤光片光片ICG (810-875nm) QD800, AlexaFluor 750, DiR, IRDye800CWCy5.5 (695-770nm) AlexaFluor 680 a

20、nd 700, Cy5.5DsRed (575-650nm) mCherry, mTomato, DsRed, QD605, TurboFP635GFP (515-575nm) GFP, EGFP, FITC0.10.1445 - 490 nm515 - 575 nm575 - 650 nm500 - 550 nm615 - 665 nm695 - 770 nm710 - 760 nm810 - 875 nm4005006007008000.11Wavelength (nm)Normalized Intensitynormalized transmission oflight through

21、1cm of tissue110.1146荧光图像获取荧光图像获取 光源水平光源水平High / Low选择选择Fluorescent 成像模式成像模式选择滤光片选择滤光片Fluorescence47Radiant Efficiency = Emission Light (photons/sec/cm2/str)Excitation Light (mW/cm2)_Fluorescence荧光校准单位荧光校准单位: : Efficiency48荧光校准单位：荧光校准单位： 辐射效率辐射效率（ （Radiant Efficiency） ）Excitation Light PatternGFP Well Plate Corrected GFP Well Plate Uncorrectedvs.CountsRadiant EfficiencyRadiant Efficiency实现了对不一致实现了对不一致激发光带型的补偿激发光带型的补偿49GFPDsRedCy5.5 ICGFluorescence对照小鼠的自发荧光对照小鼠的自发荧光550 nm610 nm740 nm840 nm50Regular Rodent FoodAlfalfa Free Rodent FoodFluorescence食物在动物体内的自发荧光食物在动物体内的自发荧光51Fluorescence自发荧光