western blot

1、western blotwestern blot原理介绍 胶的成分：胶的成分： 水，丙烯酰胺，水，丙烯酰胺，SDSSDS，Tris-ClTris-Cl，TEMEDTEMED 各成分的作用：各成分的作用：丙烯酰胺：聚合后形成网格结构丙烯酰胺：聚合后形成网格结构SDSSDS：去蛋白质：去蛋白质电荷电荷、解离蛋白质之间的、解离蛋白质之间的氢键氢键、取消蛋白分、取消蛋白分子内的子内的疏水作用疏水作用、去去多肽多肽折叠折叠，使蛋白质变成，使蛋白质变成统一构型统一构型TrisTris缓冲液：不同的缓冲液：不同的pHpH值对于蛋白的浓缩和分离很重要值对于蛋白的浓缩和分离很重要APSAPS：提供驱动丙烯酰胺和

2、双丙烯酰胺聚合所必需的：提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由自由基基（保存期：（保存期：44一周）一周）TEMEDTEMED：催凝剂催凝剂 电泳液成分：电泳液成分：TrisTris，甘氨酸（，甘氨酸（GlyGly），），SDSSDS 转膜液成分：转膜液成分：TrisTris，GlyGly，甲醇，甲醇 二者均不需要调节二者均不需要调节pHpH 经过经过PAGEPAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离

3、的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达蛋白水平的表达. .基本步骤 样品制备样品制备 组织组织/ /细胞裂解：加裂解液细胞裂解：加裂解液(TNE (TNE 加上蛋白抑加上蛋白抑制剂酶等制剂酶等)

4、)，44翻转翻转40min40min，离心取上清，离心取上清，44操操作作 蛋白浓度测定：上样时应按一定比例蛋白量添蛋白浓度测定：上样时应按一定比例蛋白量添加加 加加sample buffersample buffer： 分为还原型和非还原型，还原型上样缓冲液中分为还原型和非还原型，还原型上样缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链间二硫键的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链间二硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离，断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离，在电泳凝胶上显现多个蛋白条带在电泳凝胶上显现多个蛋白条带 主要作用：蛋白变性解链，增加比重，增加粘稠主要作用：蛋白变性解链，增加比

5、重，增加粘稠度，溴酚蓝指示作用度，溴酚蓝指示作用 配胶 浓缩胶堆积作用，浓缩胶堆积作用，浓缩胶浓度较小，孔径较大浓缩胶浓度较小，孔径较大，把较稀的，把较稀的样品加到浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩样品加到浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带，当至一个狭窄的区带，当样品液和浓缩胶选样品液和浓缩胶选TRIS/HCLTRIS/HCL缓冲液，缓冲液，电极液选电极液选TRIS/TRIS/甘氨酸甘氨酸 电泳开始后，电泳开始后，HClHCl解离出氯离子，解离出氯离子，甘氨酸解离出甘氨酸离子，蛋白质带负电荷，因此一起向甘氨酸解离出甘氨酸离子，蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，

6、其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中，电泳开始，氯离子涌动率最大，超过蛋白，因此在后中，电泳开始，氯离子涌动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，产生较面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，产生较高电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成稳定高电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层 上样与电泳上样与电泳 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGESDS

7、-PAGE 胶加样孔内即可。两边加上胶加样孔内即可。两边加上BufferBuffer 电泳恒流电泳恒流32mA32mA每块胶。每块胶。 转膜转膜 选用选用PVDFPVDF膜。可以设定转膜电流为膜。可以设定转膜电流为400mA400mA，转膜，转膜时间为时间为120120分钟。分钟。 在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，把转膜槽放置在冰浴会有非常严重的发热现象，把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜时注意正负极中进行转膜。转膜时注意正负极 电转搜索液中电转搜索液中SDSSDS增加蛋白的水溶性，促进蛋白在电转液中增加蛋白的水溶性，

8、促进蛋白在电转液中泳动。若不加泳动。若不加SDSSDS，蛋白会沉淀在胶上，但，蛋白会沉淀在胶上，但SDSSDS过多会影响蛋过多会影响蛋白与膜的吸附。甲醇能使白与膜的吸附。甲醇能使SDSSDS与蛋白分离，甲醇浓度越高与蛋白分离，甲醇浓度越高SDSSDS与蛋白分离越快，但高浓度的甲醇对蛋白会有固定作用，不与蛋白分离越快，但高浓度的甲醇对蛋白会有固定作用，不利于蛋白从胶里跑出来。一般来说甲醇的浓度为利于蛋白从胶里跑出来。一般来说甲醇的浓度为20%20%，但，但PVDFPVDF膜截留膜截留markermarker上交联的小分子颜料的能力很差，可考虑上交联的小分子颜料的能力很差，可考虑提升甲醇的浓度至提

9、升甲醇的浓度至25%25%（它对普通蛋白的转膜影响不太，颜（它对普通蛋白的转膜影响不太，颜料截留更多）；大蛋白转印可考虑降低甲醇浓度，另外料截留更多）；大蛋白转印可考虑降低甲醇浓度，另外SDSSDS必须添加。甲醇的另一个作用是降温，旧的电转液由于电解必须添加。甲醇的另一个作用是降温，旧的电转液由于电解质的消耗和甲醇的挥发，电转时电流或电压变化更快、温度质的消耗和甲醇的挥发，电转时电流或电压变化更快、温度升高也更快，因此可考虑增加额外的甲醇；这点对半干转缓升高也更快，因此可考虑增加额外的甲醇；这点对半干转缓冲液的意义较大，因为半干转缓冲液消耗很慢，缓冲液放置冲液的意义较大，因为半干转缓冲液消耗很

10、慢，缓冲液放置的时间较久，甲醇挥发比较严重，可临时少量补加的时间较久，甲醇挥发比较严重，可临时少量补加 封闭封闭(Blocking) (Blocking) 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的TBSTTBST洗涤液中，漂洗洗涤液中，漂洗1-21-2分钟，以洗去膜上的转膜分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。一般将滤纸一同转入漂洗的盒子中，再除去滤纸一般将滤纸一同转入漂洗的盒子中，再除去滤纸和胶

11、和胶 加入封闭液，在摇床上缓慢摇动加入封闭液，在摇床上缓慢摇动, ,室温封闭室温封闭6060分分钟钟。 一抗孵育一抗孵育 室温或室温或44在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在孵育一小时效果不佳，可以在44缓慢摇动孵育过夜。缓慢摇动孵育过夜。 回收一抗。加入回收一抗。加入TBSTTBST洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5 5分钟，分钟，4 4次。次。 二抗孵育二抗孵育 按照适当比例用按照适当比例用WesternWestern二抗稀释液稀释辣根过氧化物二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶酶(HRP)(HRP)标记的二抗。标记的二抗。 倒掉洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或倒掉洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或44在侧在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入WesternWestern洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5min,45min,4次次 显色显色1 1）1:11:1配好显色液，用枪吸到手套上配好显色液，用枪吸到手套上2 2）用镊子捏起膜，扣到显色液体上，注意避免气泡，）用镊子捏起膜，扣