发酵分析—分光光度法

1、第二节第二节 分光光度法分光光度法常用光谱分析仪器常用光谱分析仪器紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计原子吸收分光光度计原子吸收分光光度计红外光谱仪红外光谱仪原子发射光谱仪原子发射光谱仪荧光分析仪荧光分析仪原子荧光分析仪等原子荧光分析仪等3吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理 124光度分析的方法和仪器光度分析的方法和仪器 显色反应与分析条件显色反应与分析条件 吸光光度法仪器测量误差及其消除吸光光度法仪器测量误差及其消除 内容提要内容提要5吸光光度法的应用吸光光度法的应用 一、吸光光度法的基本原理一、吸光光度法的基本原理颜色的产生颜色的产生如果把适当颜色的两种光按一定如果把适当颜色的

2、两种光按一定强度比例混合可得到白光，这两强度比例混合可得到白光，这两种颜色的光称为互补色光。种颜色的光称为互补色光。 颜色的产生：颜色的产生：不同的物质只对不同的、特定波不同的物质只对不同的、特定波长的光有较强的吸收。长的光有较强的吸收。物质对不同波长的光具物质对不同波长的光具有选择性吸收作用而产生了不同颜色。有选择性吸收作用而产生了不同颜色。物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收光吸收曲线光吸收曲线吸收峰：吸收峰：光吸收程度最大处对应的波长。光吸收程度最大处对应的波长。KMnO4的颜色的颜色及吸收光谱及吸收光谱叶绿素的结构和吸收光谱叶绿素的结构和吸收光谱光吸收的基本定律：朗伯光吸收的基本定

3、律：朗伯比尔定律比尔定律朗伯朗伯比尔定律适用的条件比尔定律适用的条件吸光度的加和性吸光度的加和性 例例: : 钛钛-H-H2 2O O2 2和钒和钒-H-H2 2O O2 2络合物的最大吸络合物的最大吸收波长分别在收波长分别在415nm415nm和和455nm455nm处，取处，取50.00mL 50.00mL 1.061.061010-3-3mol/Lmol/L钛钛-H-H2 2O O2 2溶液，定容溶液，定容100mL, 100mL, 以以1cm1cm比色皿在比色皿在415nm415nm和和455nm455nm处测得吸光度处测得吸光度分别为分别为0.4350.435和和0.246; 0.2

4、46; 取取25.00mL 25.00mL 6.286.281010-3-3mol/L mol/L 钒钒-H-H2 2O O2 2溶液，定容溶液，定容100mL, 100mL, 以以1cm1cm比色皿在比色皿在415nm415nm和和455nm455nm处测得吸光度处测得吸光度分别为分别为0.2510.251和和0.3770.377。取。取20.00mL20.00mL钛钒混合钛钒混合液，加入液，加入H H2 2O O2 2显色后定容为显色后定容为100mL100mL，以上述，以上述相同的条件测得相同的条件测得A A415415=0.645, =0.645, A A455455=0.553, =

5、0.553, 求原混合液中钛和钒的浓度。求原混合液中钛和钒的浓度。 =8.21102 Lmol-1cm-1 =4.64102 Lmol-1cm-1 =1.60102 Lmol-1cm-1 =2.40102 Lmol-1cm-13Ti4151006. 112435. 03Ti4551006. 12246. 03V4151028.64251.03V4551028.64377.0VV455TiTi455455VV415TiTi415415bcbcAbcbcAmol/L1026.1mol/L1039.53V4Ticc)mol/L(1030. 651026. 1)mol/L(1067. 251039.

6、533V34Ticc原原二、光度分析的方法和仪器二、光度分析的方法和仪器721 可见分光光度计可见分光光度计722系列系列 可见分光光度计可见分光光度计751分光光度计分光光度计SP-756P紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计单色器单色器单色器单色器(monochromator) 是一种把来自光源的复合光分是一种把来自光源的复合光分解为单色光，并分离出所需波长光束的装置。解为单色光，并分离出所需波长光束的装置。组成：入射狭缝、准直镜、色散元件、出射狭缝组成：入射狭缝、准直镜、色散元件、出射狭缝入射狭缝：限制杂散光进入入射狭缝：限制杂散光进入色散元件色散元件：将复合光分解为单色光，有：将复合光

7、分解为单色光，有棱镜棱镜和和光栅光栅两种两种准直镜：将来自色散元件的平行光束聚集在出射狭缝上准直镜：将来自色散元件的平行光束聚集在出射狭缝上出射狭缝：将固定波长范围的光射出单色器，可以限出射狭缝：将固定波长范围的光射出单色器，可以限制通带宽度。制通带宽度。单色器的性能直接影响射出光的纯度，从而影响测定单色器的性能直接影响射出光的纯度，从而影响测定的灵敏度、选择性及校正曲线的线性范围。单色器质的灵敏度、选择性及校正曲线的线性范围。单色器质量好坏，主要取决于色散元件的质量。量好坏，主要取决于色散元件的质量。检测器检测器在测量中须把光信号变化转换成电信号的变化才能定量在测量中须把光信号变化转换成电信

8、号的变化才能定量测量，这种把光信号转换成电信号的装置称为光电转换测量，这种把光信号转换成电信号的装置称为光电转换器器 检测器。检测器。对检测器的要求主要有：对检测器的要求主要有： 产生的电信号必须与照射到它上面的光束的强度产生的电信号必须与照射到它上面的光束的强度有恒定函数关系；有恒定函数关系； 必须能对一个很大的波长范围的光具有响应，否必须能对一个很大的波长范围的光具有响应，否则应用局限性大；则应用局限性大； 灵敏度要高，响应速度要快，产生的电信号要易灵敏度要高，响应速度要快，产生的电信号要易于检测或放大且噪声要低。于检测或放大且噪声要低。常用检测器：光电管、光电倍增管、光电二极管阵列、常用

9、检测器：光电管、光电倍增管、光电二极管阵列、 光电池、电荷耦合器件。光电池、电荷耦合器件。 光电管光电管光电管光电管 (phototube) 是由封装在真空封套里的一个半圆柱是由封装在真空封套里的一个半圆柱面形阴极和一个丝状阳极组成。阴极的凹面上有一层对面形阴极和一个丝状阳极组成。阴极的凹面上有一层对光敏感的碱金属或其氧化物，受光照射可发射光电子。光敏感的碱金属或其氧化物，受光照射可发射光电子。当在两极间加上电压时，当在两极间加上电压时，即会产生光电流，流经即会产生光电流，流经负载电阻负载电阻 ( 一般一般106109 ) 时会产生时会产生一定电压降。经放大一定电压降。经放大后将信号输给指示仪

10、后将信号输给指示仪表或记录仪。表或记录仪。紫敏光电管阴极表面涂有锑和铯，适用紫敏光电管阴极表面涂有锑和铯，适用200625nm红敏光电管阴极表面涂有银或氧化铯，适用红敏光电管阴极表面涂有银或氧化铯，适用6251000nm光电倍增管光电倍增管光电倍增管光电倍增管(photomultiplier)是由一个光阴极和多个二次是由一个光阴极和多个二次发射电极发射电极 (打拿极打拿极)和阳极所组成，其灵敏度比光电管要和阳极所组成，其灵敏度比光电管要高得多。高得多。912个打拿级个打拿级1个光电子可个光电子可产生产生106108个电子个电子可检可检10-810-9s短脉冲信号短脉冲信号光电二极管阵列光电二极

11、管阵列光电二极管阵列光电二极管阵列 (photodiode array) 检测器为多道光检测检测器为多道光检测器，可同时检测多个波长的光强度。器，可同时检测多个波长的光强度。优点优点: 不怕强光、耐振动、耐冲击、小型、重量轻、耗不怕强光、耐振动、耐冲击、小型、重量轻、耗电少、寿命长、可靠性高及读出速度快等优点，不存在电少、寿命长、可靠性高及读出速度快等优点，不存在时间滞后现象，可应用于化学反应动力学研究。时间滞后现象，可应用于化学反应动力学研究。分光光度计类型分光光度计类型单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计(1) 同时测量参比池和样品池，同时测量参比池和样品池，(2) 双单色器，提高

12、分辨率降低杂散光双单色器，提高分辨率降低杂散光(3) 自动测量自动测量(4) 附件扩展功能附件扩展功能常用型号：北京普析通用公司常用型号：北京普析通用公司TU-1221型型/T6，岛津，岛津UV-2501型，型，PE的的Lambda系列及系列及HP的的8453型等。型等。特点：特点：双光束光度计双光束光度计动 画(三三) 双波长分光光度计双波长分光光度计为克服由于非特征吸收信号为克服由于非特征吸收信号 ( 如试液混浊引起的散射，如试液混浊引起的散射，比色皿与空气界面和比色皿与溶液界面的折射差别等比色皿与空气界面和比色皿与溶液界面的折射差别等)影响而带来测定误差，而设计双波长分光光度计。影响而带

13、来测定误差，而设计双波长分光光度计。测定高浓度试样和混浊试样以及多组分混合物的定量测定高浓度试样和混浊试样以及多组分混合物的定量分析具有很大优越性，提高了测量灵敏度和准确度。分析具有很大优越性，提高了测量灵敏度和准确度。三、显色反应及分析条件的选择三、显色反应及分析条件的选择显色反应条件的选择显色反应条件的选择四、吸光光度法仪器测量误差及其消除四、吸光光度法仪器测量误差及其消除入射光波长的选择入射光波长的选择光度计读数范围的选择光度计读数范围的选择参比溶液的选择参比溶液的选择溶液浓度的测定溶液浓度的测定工作曲线法工作曲线法绘制工作曲线；绘制工作曲线；测样品测样品A，在曲线上获得对应浓度。，在曲

14、线上获得对应浓度。比较法比较法五、吸光光度法的应用五、吸光光度法的应用六、紫外吸收光谱分析法 波长10400nm为紫外光，10200nm为远紫外光，200400nm为近紫外光。有机化合物结构与紫外信息的关系（1）200-400nm 无吸收峰。饱和化合物，单烯。无吸收峰。饱和化合物，单烯。（2） 270-350 nm有吸收峰（有吸收峰（=10-100）醛酮）醛酮 n* 跃跃迁产生的迁产生的R 带。带。（3） 250-300 nm 有中等强度的吸收峰（有中等强度的吸收峰（=200-2000），芳环的特征），芳环的特征 吸收（具有精细解构的吸收（具有精细解构的B带）。带）。（4） 200-250 nm有强吸收峰（有强吸收峰（ 104），表明含有一），表明含有一个共轭体系（个共轭体系（K）带。共轭二烯：）带。共轭二烯：K带（带（ 230 nm）；）；不饱和醛酮：不饱和醛酮：K带带 230 nm ，R带带 310-330 nm 260nm,300 nm,330 nm有强吸收峰有强吸收峰，3,4,5个双键的共个双键的共轭体系轭体系。苯和N-亚硝基二甲胺的紫外吸收光谱图红移与蓝移有机化合物的吸收谱有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸或改变溶剂使最大吸收波长收波长max和吸收强和吸收强度发生变化