细胞实验基本操作与实验室要求

1、LOGO第三章 细胞工程实验室及实验基本操作 第一节 实验室及仪器设备 第二节 实验基本操作 第三节 培养基及其配制第一节 实验室及仪器设备细胞工程实验室要能满足清洗、无细胞工程实验室要能满足清洗、无菌操作、培养基制备、贮藏和培养菌操作、培养基制备、贮藏和培养鉴定等多方面的要求。鉴定等多方面的要求。1、植植物物实实验验室室基本操作室基本操作室无菌操作室无菌操作室培养室培养室鉴定分析室鉴定分析室温温 室室一、实验室2 2、动物细胞培养室、动物细胞培养室原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无尘。环境清洁、空气清新，干燥和

2、无尘。 实验室设置上至少有实验室设置上至少有4 4个房间：个房间：基本操作室基本操作室，洗涤，灭菌。，洗涤，灭菌。缓冲间缓冲间，位于准备室和培养室之间。，位于准备室和培养室之间。无菌培养室无菌培养室，内有超净工作台，一般应在内侧，室，内有超净工作台，一般应在内侧，室内可消毒，培养箱。内可消毒，培养箱。鉴定分析室鉴定分析室，用于细胞的观察和分析研究。，用于细胞的观察和分析研究。二、实验室仪器设备（一）必要器皿1 1、培养器皿（动物细胞培养一般为塑料器皿，优、培养器皿（动物细胞培养一般为塑料器皿，优点是一次性使用，已消毒灭菌密封包装，打开即点是一次性使用，已消毒灭菌密封包装，打开即可用；植物细胞培

3、养一般用三角瓶）可用；植物细胞培养一般用三角瓶）2 2、盛装器皿（各种玻璃器皿）、盛装器皿（各种玻璃器皿）3 3、计量器皿（量筒、吸管、加样器等）、计量器皿（量筒、吸管、加样器等）4 4、金属器皿（用于解剖、取材、剪切组织等）、金属器皿（用于解剖、取材、剪切组织等）（二）常用仪器设备1 1无菌操作仪器设备无菌操作仪器设备 医用超净工作台医用超净工作台( (气流水平型和垂直型气流水平型和垂直型) )，高压蒸，高压蒸汽灭菌锅汽灭菌锅( (手提式、立式手提式、立式) )，干热灭菌烘箱，过滤，干热灭菌烘箱，过滤除菌装置。除菌装置。2 2培养仪器设备培养仪器设备 植物：培养架、摇床、振荡式培养机植物：培

4、养架、摇床、振荡式培养机(100次次/min)、恒温恒湿光照培养箱、暗培养箱等。恒温恒湿光照培养箱、暗培养箱等。 动物：恒温培养箱及动物：恒温培养箱及CO2恒温培养箱。恒温培养箱。3 3药品存贮和配制仪器设备药品存贮和配制仪器设备4 4观察分析仪器设备观察分析仪器设备 显微镜（高倍、倒置、实体解剖和荧光显微镜显微镜（高倍、倒置、实体解剖和荧光显微镜等）及配套照相系统、解剖镜、离心机、液氮等）及配套照相系统、解剖镜、离心机、液氮容器、恒温箱、精密天平等。容器、恒温箱、精密天平等。5 5其它仪器设备，如流式细胞仪，酶标仪等。其它仪器设备，如流式细胞仪，酶标仪等。二氧化碳细胞培养箱二氧化碳细胞培养箱

5、MB-IV 型型 酶酶 标标 检检 测测 仪仪 第二节第二节 实验室的基本操作实验室的基本操作v实验室的基本操作是围绕实验室的基本操作是围绕无菌无菌要求进行的，主要要求进行的，主要包括清洗、消毒灭菌，无菌操作等。包括清洗、消毒灭菌，无菌操作等。一、清洗未用过的玻璃器皿：未用过的玻璃器皿：常有游离碱性物质，使用前，常有游离碱性物质，使用前，先用先用1%1%稀盐酸浸泡一夜，然后用洗衣粉洗涤，清稀盐酸浸泡一夜，然后用洗衣粉洗涤，清水冲洗，蒸馏水冲洗一遍，晾干备用。水冲洗，蒸馏水冲洗一遍，晾干备用。已用过的玻璃器皿：已用过的玻璃器皿：用洗衣粉刷洗，清水冲洗，用洗衣粉刷洗，清水冲洗，晾干备用。晾干备用。

6、新的塑料器皿：新的塑料器皿：打开即用。打开即用。已用过的塑料器皿已用过的塑料器皿金属器皿：金属器皿：一般不宜用洗涤液洗涤，新的用热洗一般不宜用洗涤液洗涤，新的用热洗衣粉水洗净、冲洗后，蒸馏水冲洗擦干即可。衣粉水洗净、冲洗后，蒸馏水冲洗擦干即可。细胞培养的玻璃器皿常需用洗液浸泡，再拿出冲洗，细胞培养的玻璃器皿常需用洗液浸泡，再拿出冲洗，洗液配方如下：洗液配方如下：配方成分配方成分弱液弱液次强液次强液强液强液常用配方常用配方重铬酸钾重铬酸钾(g)浓硫酸浓硫酸(ml)蒸馏水蒸馏水(ml) 501001000 1002001000 60800200100200800 1、KCrO4液要冷却后才能加浓硫

7、酸。以防暴沸。液要冷却后才能加浓硫酸。以防暴沸。2、浓硫酸要慢慢倒入、浓硫酸要慢慢倒入KCrO4液中。液中。3、洗液要密封保存，以免失效。、洗液要密封保存，以免失效。正常洗液黑棕色正常洗液黑棕色 蓝绿色（效用变弱）蓝绿色（效用变弱）二、消毒灭菌严格的消毒灭菌起着至关重要的作用，主要物理灭严格的消毒灭菌起着至关重要的作用，主要物理灭菌方法有：菌方法有：v 湿热灭菌湿热灭菌:高温高压法、流动蒸汽或沸水高温高压法、流动蒸汽或沸水121，1.0-1.1 Kg/cm2，20-30分钟分钟v 干热灭菌干热灭菌：烤箱、焚烧、酒精灯：烤箱、焚烧、酒精灯,于于150恒温恒温40 min, 或或120恒温恒温2h

8、，或或160恒温恒温1.5-2h (芽孢杆菌芽孢杆菌)v 射线照射灭菌射线照射灭菌：紫外线：紫外线(细胞培养室，超净工作细胞培养室，超净工作台台)、电离辐射、电离辐射 v 过滤灭菌过滤灭菌：微孔滤膜、玻璃丝滤器：微孔滤膜、玻璃丝滤器 0.22-高温高压灭菌可能出现的问题：高温高压灭菌可能出现的问题：l pH值下降值下降0.3-0.5l 太高温度灭菌时可能使糖焦化，可能产生毒性，太高温度灭菌时可能使糖焦化，可能产生毒性，对有些培养基应选择合适条件灭菌。对有些培养基应选择合适条件灭菌。l 灭菌时间过长使盐沉淀，同时使琼脂解聚灭菌时间过长使盐沉淀，同时使琼脂解聚l 挥发性物质不能高温灭菌，否则会被破

9、坏挥发性物质不能高温灭菌，否则会被破坏化学消毒灭菌主要有：化学消毒灭菌主要有：v 熏蒸灭菌熏蒸灭菌药物蒸汽对室内空气进行杀菌。药物蒸汽对室内空气进行杀菌。甲醛和高锰酸钾混合后产生大量蒸汽。甲醛和高锰酸钾混合后产生大量蒸汽。醋烧开。醋烧开。v 化学药品灭菌化学药品灭菌7070% % -75%-75%酒精，酒精，升汞升汞漂白粉漂白粉新洁尔敏新洁尔敏过氧化氢过氧化氢v 抗生素抑菌法抗生素抑菌法 青霉素、链霉素、新霉素青霉素、链霉素、新霉素消毒剂消毒剂使用浓度使用浓度(%)去除难易去除难易消毒时间消毒时间(min)效果效果次氯酸钙次氯酸钙次氯酸钠次氯酸钠漂白粉漂白粉溴水溴水过氧化氢过氧化氢升汞升汞酒精

10、酒精抗生素抗生素硝酸银硝酸银9102饱和溶液饱和溶液1210120.11707545(mg/L)1易易易易易易易易最易最易较难较难易易中中较难较难5305305302105152100.223060530很好很好很好很好很好很好很好很好好好最好最好好好较好较好好好常用消毒剂消毒灭菌效果比较表常用消毒剂消毒灭菌效果比较表三、无 菌 操 作1、无菌操作前的准备工作：、无菌操作前的准备工作：l 穿好工作服、戴上工作帽和口罩。穿好工作服、戴上工作帽和口罩。l 将各种操作所用的金属器械浸泡在将各种操作所用的金属器械浸泡在95或或70的酒精，的酒精，点燃酒精灯。点燃酒精灯。l 将耐热器皿（不锈钢小盘）中加

11、入少量酒精，将蘸有将耐热器皿（不锈钢小盘）中加入少量酒精，将蘸有酒精的金属器械及器械支架放入耐热器皿中灼烧，待酒精的金属器械及器械支架放入耐热器皿中灼烧，待凉后备用。凉后备用。l 用用7075的酒精擦拭新培养容器和继代培养容器的酒精擦拭新培养容器和继代培养容器表面，放置超净台上待用。表面，放置超净台上待用。l 用上述浓度的酒精擦拭双手和前臂。用上述浓度的酒精擦拭双手和前臂。2 2、无菌操作步骤、无菌操作步骤l 将培养材料灭菌后放入已消毒的培养皿中，置于将培养材料灭菌后放入已消毒的培养皿中，置于超净工作台酒精灯火焰下方，进行适当切割或其他处超净工作台酒精灯火焰下方，进行适当切割或其他处理。理。l

12、 在酒精灯火焰处将培养瓶盖轻轻打开，瓶口在火在酒精灯火焰处将培养瓶盖轻轻打开，瓶口在火焰处旋转灼烧。焰处旋转灼烧。l 将镊子过火，用镊子将培养材料置于培养基上将镊子过火，用镊子将培养材料置于培养基上l 将镊子、瓶口及塞子过火后盖回瓶口。将镊子、瓶口及塞子过火后盖回瓶口。 继代培养用灭菌的器具（镊子或吸管）继代培养用灭菌的器具（镊子或吸管） 直接将培养材料放置在新培养基上。直接将培养材料放置在新培养基上。第三节 培养基及其配制定义定义：培养基是离体培养组织或细胞：培养基是离体培养组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供的近似生物体内生存的营养材料提供的近

13、似生物体内生存的营养环境。环境。没有任何一种培养基能够适合一切类没有任何一种培养基能够适合一切类型的组织、细胞和器官的培养。型的组织、细胞和器官的培养。必要元素在细胞内的主要生理作用必要元素在细胞内的主要生理作用 组成各种化合物，参与有机体的构造，成为组成各种化合物，参与有机体的构造，成为结构物质。结构物质。 构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的生理代谢。生理代谢。 元素间互相协调，维持离子浓度平衡、胶体元素间互相协调，维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面的作用。稳定、电荷平衡等电化学方面的作用。 调节形态发生和组织器官的建成。调节形态发生和

14、组织器官的建成。一、植物细胞培养基及其配制 完善的植物培养基配方为：完善的植物培养基配方为： 水分水分 无机营养成分无机营养成分 有机营养成分有机营养成分 生长调节物质生长调节物质 琼脂琼脂 Some common media formulations (mg/L) Anderson MS N & N WPM NH4NO3 400 1650 720 400 KNO3 480 1900 950 K2SO4 990 KH2PO4 170 68 170 NaH2PO4 * H2O 380 CaCl2 166 CaCl2 * 2H2O 440 440 96 Ca(NO3)2 * 4H2O 55

15、6 MgSO4 * 7H2O 370 370 185 370 H3BO3 6.2 6.2 10 6.2 MnSO4 * H2O 16.9 MnSO4 * 4H2O 22.3 25 22.3 ZnSO4 * 7H2O 8.6 8.6 10 8.6 KI 0.3 0.83 Na2MoO4 * 2H2O 0.25 0.25 0.25 0.25 CuSO4 * 5H2O 0.025 0.025 0.025 0.25 CoCl2 * 6H2O 0.025 0.025 FeSO4 * 7H2O 55.7 27.8 27.8 27.8 Na2EDTA * 2H2O 74.5 37.2 37.2 37.2 （

16、一） 培养基成分1 1、无机元素、无机元素氮氮-各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要组各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要组成成分。成成分。钙钙-细胞壁的成分之一细胞壁的成分之一铁、锌、钼铁、锌、钼-某些酶的组成成分某些酶的组成成分v植物缺乏无机元素可能引起的疾病：植物失绿、细植物缺乏无机元素可能引起的疾病：植物失绿、细胞分裂停止、细胞分化受阻等。胞分裂停止、细胞分化受阻等。v营养元素过多可以引起植物细胞代谢障碍、生长抑营养元素过多可以引起植物细胞代谢障碍、生长抑制。制。2 2、有机营养成分、有机营养成分v提供促进培养细胞生长和分化所必需的有机碳、提供促进培养细胞生长和分化所必需的有机碳、

17、氮等营养物质，包括：氮等营养物质，包括： 氨基酸类氨基酸类 维生素类维生素类 糖类糖类 天然有机添加物类天然有机添加物类氨基酸类氨基酸类v常用：甘氨酸常用：甘氨酸v有时用：丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、有时用：丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白和水解乳蛋白等。水解酪蛋白和水解乳蛋白等。v用量通常为用量通常为2 2-3mg/L-3mg/L。v水解酪蛋白水解酪蛋白CH和水解乳蛋白和水解乳蛋白LH，对培养材料的，对培养材料的细胞分化有良好的促进作用，用量为细胞分化有良好的促进作用，用量为100100-2 -2 000mg/L000mg/L维生素类维生素类v维生素类是以辅酶形式参与植

18、物细胞代谢活动的重维生素类是以辅酶形式参与植物细胞代谢活动的重要物质，对生长、分化有很好的促进作用。要物质，对生长、分化有很好的促进作用。 用量：用量：0.1-10mg/L 常用：常用：盐酸硫胺素（维生素盐酸硫胺素（维生素B1） 盐酸吡哆醇（维生素盐酸吡哆醇（维生素B6） 烟酸（维生素烟酸（维生素B3） 叶酸（维生素叶酸（维生素Bc） 有时用：生物素（维生素有时用：生物素（维生素H） 泛酸钙（维生素泛酸钙（维生素B5） 抗坏血酸（维生素抗坏血酸（维生素C）糖类糖类v糖类是培养基的主要碳源。糖类是培养基的主要碳源。v常用碳源是蔗糖，还有葡萄糖、果糖、麦芽糖、常用碳源是蔗糖，还有葡萄糖、果糖、麦芽

19、糖、木糖、甘露糖、山梨糖等。木糖、甘露糖、山梨糖等。v适宜的浓度为适宜的浓度为2%2%-5%-5%。离体双子叶植物根：以蔗糖为碳源最好。离体双子叶植物根：以蔗糖为碳源最好。单子叶植物的根：以右旋糖（葡萄糖）为碳源最好。单子叶植物的根：以右旋糖（葡萄糖）为碳源最好。肌肌 醇醇在糖类的互相转化中起作用，是培养基中不可缺在糖类的互相转化中起作用，是培养基中不可缺少的有机营养。少的有机营养。形成细胞壁的构建物质：果胶质形成细胞壁的构建物质：果胶质 。 形成植酸形成植酸 与与Ca2+、Mg2+结合成植酸钙镁。结合成植酸钙镁。 形成磷脂，细胞膜组分。形成磷脂，细胞膜组分。可见肌醇参与了碳水化合物、磷脂代谢

20、和离子平可见肌醇参与了碳水化合物、磷脂代谢和离子平衡等生理活动。衡等生理活动。用量为用量为50-100mg/L。 天然有机添加物类天然有机添加物类v椰乳、马铃薯汁、酵母提取液、番茄汁等。椰乳、马铃薯汁、酵母提取液、番茄汁等。 v化学成分不明的复杂营养混合物，对细胞和组化学成分不明的复杂营养混合物，对细胞和组织的生长和分化有明显的促进作用，但质和量织的生长和分化有明显的促进作用，但质和量受多种因素影响，实验的可重复性差。受多种因素影响，实验的可重复性差。生长调节物质生长调节物质v是促进培养植物生长良好的主要因素。是促进培养植物生长良好的主要因素。v由无机和有机营养构成的培养基仅保证了培养由无机和

21、有机营养构成的培养基仅保证了培养物的生存，只有配以适当的植物生长调节物质物的生存，只有配以适当的植物生长调节物质时，才能诱导细胞分裂的启动，愈伤组织生长时，才能诱导细胞分裂的启动，愈伤组织生长及根、芽分化和胚状体的发育。及根、芽分化和胚状体的发育。v植物生长调节物质包括：植物生长调节物质包括： 生长素（生长素（auxin）类类 细胞分裂素类（细胞分裂素类（cytokinin） 赤霉素（赤霉素（gibberellin）类类 脱落酸（脱落酸（abscisic acid） 乙烯（乙烯（ethylene）等等 生长素类生长素类组织培养中生长素的作用：组织培养中生长素的作用： 促进细胞伸长生长和细胞分裂

22、促进细胞伸长生长和细胞分裂 诱导愈伤组织形成诱导愈伤组织形成 促进生根促进生根 诱导不定芽的分化（与细胞分裂素配合）诱导不定芽的分化（与细胞分裂素配合） 诱导侧芽的萌发与生长诱导侧芽的萌发与生长 胚状体的产生等胚状体的产生等v常用生长素有：常用生长素有： 2,4- 2,4-二氯苯氧乙酸：二氯苯氧乙酸：有抑制芽形成的副作用，有抑制芽形成的副作用，一般用于启动细胞的脱分化。一般用于启动细胞的脱分化。 诱导分化则用诱导分化则用NAANAA或或IBAIBA、IAAIAA。 萘乙酸（萘乙酸（NAANAA） 吲哚丁酸（吲哚丁酸（IBAIBA）：人工合成，人工合成，120120C C仍很仍很 稳定。组织培养

23、中常用。生根效果好。稳定。组织培养中常用。生根效果好。 吲哚乙酸（吲哚乙酸（IAAIAA）等：等：天然植物生长素，见光天然植物生长素，见光易分解，高温高压易破坏。易分解，高温高压易破坏。细胞分裂素类细胞分裂素类v细胞分裂素的作用：细胞分裂素的作用： 促进细胞分裂促进细胞分裂 诱导愈伤组织或器官分化不定芽诱导愈伤组织或器官分化不定芽 抑制顶端优势而促进茎的增殖抑制顶端优势而促进茎的增殖 抑制离体组织或器官衰老等抑制离体组织或器官衰老等常用的细胞分裂素有：常用的细胞分裂素有：激动素或糖基腺嘌呤（激动素或糖基腺嘌呤（kinetin，KT）（见光易（见光易分解，需暗处保存）分解，需暗处保存） 6-苄基

24、腺嘌呤（苄基腺嘌呤（6-BA） 2-异戊烯腺嘌呤（异戊烯腺嘌呤（2-Zip） 玉米素（玉米素（zeatin，ZT）等等赤霉素类赤霉素类v赤霉素（赤霉素（gibberellin，GA）有有20多种。多种。v组织培养中仅使用组织培养中仅使用GA3一种：能促进诱导形成一种：能促进诱导形成的不定胚正常发育成小植株。的不定胚正常发育成小植株。vGA3不耐热，溶水后不稳定，需溶于酒精中，不耐热，溶水后不稳定，需溶于酒精中，过滤除菌。过滤除菌。 脱落酸脱落酸脱落酸（脱落酸（abscisic acid，ABA）的作用：的作用： 抑制蛋白质合成抑制蛋白质合成 抵消和抑制生长素、细胞分裂素和抵消和抑制生长素、细胞

25、分裂素和GA发挥作用发挥作用 诱导休眠诱导休眠 促进衰老和脱落促进衰老和脱落 抑制气孔开放，减少蒸腾作用抑制气孔开放，减少蒸腾作用 对一些培养物芽的形成有促进作用对一些培养物芽的形成有促进作用短日照条件诱导脱落酸合成，延缓生长、促进短日照条件诱导脱落酸合成，延缓生长、促进落叶、形成休眠芽（秋季）。落叶、形成休眠芽（秋季）。长日照条件诱导赤霉素合成，促进生长、诱导长日照条件诱导赤霉素合成，促进生长、诱导开花（春夏季）。开花（春夏季）。乙烯乙烯v乙烯的作用：乙烯的作用： 具有促熟果实具有促熟果实 促进脱落和衰老促进脱落和衰老 促进橡胶、漆、松脂等次生物质的排泌促进橡胶、漆、松脂等次生物质的排泌 促

26、进菠萝开花促进菠萝开花 增加黄瓜等雌花数量等增加黄瓜等雌花数量等v培养时植物组织自身会散发出乙烯。培养时植物组织自身会散发出乙烯。v生长素用量过高时会诱导植物产生乙烯。生长素用量过高时会诱导植物产生乙烯。v较高的乙烯引起植物发生形态变化：豌豆上胚轴较高的乙烯引起植物发生形态变化：豌豆上胚轴加粗、失去负向地性等。加粗、失去负向地性等。v用高锰酸钾进行吸附可减少乙烯含量。用高锰酸钾进行吸附可减少乙烯含量。v常用乙烯利（常用乙烯利（2-氯乙基膦酸氯乙基膦酸）：）：在在pH值高于值高于4.1时，时，即分解释放出乙烯。即分解释放出乙烯。琼琼 脂脂v固体培养基最好的固化剂是琼脂。固体培养基最好的固化剂是琼

27、脂。v是从海藻中提取的一种高分子多糖类物质，不是从海藻中提取的一种高分子多糖类物质，不提供任何营养成分，培养材料良好的支持物。提供任何营养成分，培养材料良好的支持物。v用量为用量为3 3-10g/L-10g/L。v溶于热水，在溶于热水，在4040C C以下凝固为凝胶状。以下凝固为凝胶状。v琼脂能吸附细胞代谢中的一些废物。琼脂能吸附细胞代谢中的一些废物。v在研究组织或细胞营养代谢时，应避免使用琼在研究组织或细胞营养代谢时，应避免使用琼脂培养基，因为杂质会影响研究结果。脂培养基，因为杂质会影响研究结果。v液体培养基中用无灰滤纸制成的纸桥作为支持液体培养基中用无灰滤纸制成的纸桥作为支持物来培养愈伤组

28、织，避免了琼脂杂质的影响。物来培养愈伤组织，避免了琼脂杂质的影响。 成分成分Bacto-琼脂（琼脂（% ）Noble-琼脂（琼脂（%）纯化琼脂（纯化琼脂（% ）灰分灰分4.52.61.75钙钙0.130.230.27钡钡0.010.010.01硅质硅质0.190.260.09氯化物氯化物0.430.180.13硫酸盐硫酸盐2.541.901.32氮氮0.170.100.14铁铁11.00（mg/L）1.00（mg/L）1.00（mg/L）镁镁285.00（mg/L）260.00（mg/L）695.00（mg/L）铜铜 5.00（mg/L） 7.50（mg/L） 20.00（mg/L） 植物组织

29、培养中常用的琼脂的化学成分植物组织培养中常用的琼脂的化学成分 植物培养基的植物培养基的pHpH值值v 植物培养材料大多要求弱酸性的环境。植物培养材料大多要求弱酸性的环境。v 灭菌前需将灭菌前需将pHpH值调节到值调节到5.65.6-5.8-5.8。v 当当pHpH高于高于6 6时，培养基变硬，不利于培养物的时，培养基变硬，不利于培养物的生长。生长。v 而低于而低于5 5时，琼脂不能很好凝固。时，琼脂不能很好凝固。v 各种培养基在无机营养组成上的差异主要各种培养基在无机营养组成上的差异主要是盐和离子数量上的不同。是盐和离子数量上的不同。v 据无机盐的含量可分为：据无机盐的含量可分为：高无机盐含量

30、培养基高无机盐含量培养基 硝酸钾含量较高培养基硝酸钾含量较高培养基 中等无机盐含量培养基中等无机盐含量培养基 低无机盐含量培养基低无机盐含量培养基应用最为广泛的培养基：应用最为广泛的培养基：MSMS。1 1、高无机盐含量培养基、高无机盐含量培养基v主要有主要有MSMS和和ERER培养基。培养基。v特点：钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高。特点：钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高。 微量元素种类齐全。微量元素种类齐全。 养分数量及比例比较合适养分数量及比例比较合适v广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。质体的培养。2 2、较高硝酸钾含量培养基、较高硝酸钾含量培养基主

31、要有主要有B B5 5和和N N6 6培养基。培养基。适合于木本植物、十字花科植物和单子叶植物的适合于木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。组织和花药培养。3 3、中等无机盐含量培养基、中等无机盐含量培养基v主要有主要有NitschNitsch和和NTNT培养基。培养基。v特点：大量元素约为特点：大量元素约为MSMS培养基的一半。培养基的一半。 微量元素种类减少，但含量较微量元素种类减少，但含量较MSMS高。高。v适合于花药培养。适合于花药培养。4、低无机盐含量培养基低无机盐含量培养基v主要有主要有White 和和Heller。v特点：培养基大量元素含量大幅降低和特点：培养基大量

32、元素含量大幅降低和种类减少。种类减少。v多数用于生根培养基。多数用于生根培养基。（二）植物培养基配制母液的配制和培养基的配制母液的配制和培养基的配制1 1母液的配制母液的配制 母液的配制是按药品的种类和性质分别配制，单独母液的配制是按药品的种类和性质分别配制，单独保存或几种混合保存或几种混合45C保存。保存。配制好的母液种类一般有：大量元素、微量元素、配制好的母液种类一般有：大量元素、微量元素、钙盐、铁盐、有机营养和单独保存的各种生长调节钙盐、铁盐、有机营养和单独保存的各种生长调节类物质。类物质。 1 1、 培养基母液的配制培养基母液的配制v大量元素母液：大量元素母液：10100倍浓度。倍浓度

33、。v微量元素和有机营养母液：微量元素和有机营养母液：100倍浓度。倍浓度。v混合定容：注意药剂的添加次序及稀释度，以免发生混合定容：注意药剂的添加次序及稀释度，以免发生沉淀。沉淀。v钙盐和铁盐：分别单独配制。钙盐和铁盐：分别单独配制。v生长调节类物质：生长调节类物质：0.21.0mg/ml原液。原液。 IAA等醇溶性，先用少量等醇溶性，先用少量95%酒精溶解，再用酒精溶解，再用dH2O定定容。容。KT、6-BA、2-Zip、ZT：先溶于少量先溶于少量1mol/L盐酸，再用盐酸，再用dH2O定容。定容。叶酸：先用少量稀氨水溶解后再定容。叶酸：先用少量稀氨水溶解后再定容。培养基的配制方法培养基的配

34、制方法 在干净容器中加入终体积约在干净容器中加入终体积约3/43/4的的dHdH2 2O O及所需要的琼脂和糖，及所需要的琼脂和糖，煮沸溶解琼脂。不时搅拌以防止琼脂在锅底烧焦或沸腾溢出。煮沸溶解琼脂。不时搅拌以防止琼脂在锅底烧焦或沸腾溢出。 加入所需量的各种母液及生长调节物质（不包括过滤除菌药加入所需量的各种母液及生长调节物质（不包括过滤除菌药剂）。剂）。 加加dHdH2 2O O至近终体积，再次煮沸并加至近终体积，再次煮沸并加dHdH2 2O O至终体积。至终体积。 充分混合后用充分混合后用1 1N N盐酸或盐酸或1 1N N氢氧化钠调节氢氧化钠调节pHpH值。值。 冷却，加入过滤除菌药剂，

35、分装，冷却，加入过滤除菌药剂，分装，5050mlml培养基培养基/150/150mlml三角瓶，三角瓶，封口。封口。 高压灭菌，室温凝固备用高压灭菌，室温凝固备用。水水药品药品糖糖 混合混合 pHpH调整调整 加热溶解加热溶解琼脂琼脂玻璃器皿玻璃器皿 水洗水洗 干燥干燥 分装分装 加塞加塞 高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌 植物培养基配制程序植物培养基配制程序冷却冷却过滤灭菌药品过滤灭菌药品接种接种v需加入过滤灭菌的药品，在高压灭菌后，培养需加入过滤灭菌的药品，在高压灭菌后，培养基凝固前加入，并轻摇使混匀。基凝固前加入，并轻摇使混匀。v培养基终体积定容时，可以利用台秤通过重量培养基终体积定容时，可以利

36、用台秤通过重量进行培养基终体积的确定。进行培养基终体积的确定。v培养基的培养基的pHpH值直接影响培养物对离子的吸收，值直接影响培养物对离子的吸收，过酸或过碱不仅影响到培养材料的生长，而且过酸或过碱不仅影响到培养材料的生长，而且会影响到琼脂的凝固。会影响到琼脂的凝固。v经高压高温灭菌后，由于某些成分的降解或氧经高压高温灭菌后，由于某些成分的降解或氧化，酸度会增加（化，酸度会增加（pHpH值一般可降低值一般可降低0.20.2），调），调pHpH值时应考虑。值时应考虑。 二、动物培养基动物细胞的营养要求比植物细胞的要复杂得多。动物细胞的营养要求比植物细胞的要复杂得多。目前，绝大多数动物细胞必须在培

37、养基中添加目前，绝大多数动物细胞必须在培养基中添加血清等成分不明确的天然培养基成分，还不能血清等成分不明确的天然培养基成分，还不能在成分完全明确的培养基中生长繁殖。在成分完全明确的培养基中生长繁殖。v动物细胞培养基通常是液态。动物细胞培养基通常是液态。v根据其是否能促进细胞生长，可分为：根据其是否能促进细胞生长，可分为： 生长培养基（生长培养基（growth medium） 维持培养基（维持培养基（maintenance medium） 按来源，又可分为：按来源，又可分为： 合成培养基合成培养基 天然培养基。天然培养基。 生长培养基生长培养基v生长培养基是指用来培养细胞使其快速生长增殖生长培养

38、基是指用来培养细胞使其快速生长增殖的培养基。的培养基。v对动物细胞来说，一般只要将生长培养基中的血对动物细胞来说，一般只要将生长培养基中的血清浓度降低或全部除去，就可获得维持培养基。清浓度降低或全部除去，就可获得维持培养基。维持培养基维持培养基维持培养基是指只能用来维持培养细胞的存活，但维持培养基是指只能用来维持培养细胞的存活，但不能促使细胞生长和增殖的培养基。不能促使细胞生长和增殖的培养基。v培养细胞处于不分裂状态下，更易分泌活性产物培养细胞处于不分裂状态下，更易分泌活性产物v此时，若加入特定化学药品，可诱导细胞产生活此时，若加入特定化学药品，可诱导细胞产生活性产物；性产物；v若细胞感染了病

39、毒，则在此状态下病毒会大量扩若细胞感染了病毒，则在此状态下病毒会大量扩增，从而生产病毒疫苗。增，从而生产病毒疫苗。v特点：能在数周内使培养细胞保持良好状态，而特点：能在数周内使培养细胞保持良好状态，而不会使细胞的特性受到损害。不会使细胞的特性受到损害。v目的：提高细胞的生产力，细胞不生长，能更多目的：提高细胞的生产力，细胞不生长，能更多更快生产终产物。更快生产终产物。v维持培养基成分可能很复杂，也可能很简单。维持培养基成分可能很复杂，也可能很简单。条件培养基条件培养基在培养过程中，有些细胞可能会分泌活性物质到培在培养过程中，有些细胞可能会分泌活性物质到培养液中，这种培养过某种细胞以后，含有细胞

40、分泌养液中，这种培养过某种细胞以后，含有细胞分泌物的培养液又称为条件培养基物的培养液又称为条件培养基( (conditioned medium）。 天然培养基和合成培养基天然培养基和合成培养基v天然培养基主要包括天然培养基主要包括: :各种动物的体液（血淋巴、血各种动物的体液（血淋巴、血浆和血清）、组织提取液（胎汁、酵母提取物）等浆和血清）、组织提取液（胎汁、酵母提取物）等v合成培养基是指按照体内细胞所需营养的种类和数量合成培养基是指按照体内细胞所需营养的种类和数量配成的成分明确的培养基。配成的成分明确的培养基。v一般来说，合成培养基只能维持动物细胞的生存，要一般来说，合成培养基只能维持动物细

41、胞的生存，要想使细胞生长和增殖，还需补充部分天然培养基。想使细胞生长和增殖，还需补充部分天然培养基。 (一) 培养基的成分1 1、生长培养基、生长培养基培养动物细胞用的生长培养基组分包括培养动物细胞用的生长培养基组分包括9 9种：种：水、无机盐、微量元素、维生素、缓冲系统、能源水、无机盐、微量元素、维生素、缓冲系统、能源和碳源、氮源、激素和生长因子、添加剂等和碳源、氮源、激素和生长因子、添加剂等 水水v对水的要求极其严格对水的要求极其严格v水是细胞的主要组成成分之一，水在细胞内主水是细胞的主要组成成分之一，水在细胞内主要起溶剂作用。要起溶剂作用。 v细胞吸收的营养物质、分泌的产物、代谢的废细胞

42、吸收的营养物质、分泌的产物、代谢的废物都要溶解在水中；物都要溶解在水中；v细胞内的化学反应、细胞的运动及维持细胞内细胞内的化学反应、细胞的运动及维持细胞内外的渗透压也离不开水。外的渗透压也离不开水。v水是离体培养细胞的重要生存环境水是离体培养细胞的重要生存环境。 无机盐（大量元素）无机盐（大量元素）v解决培养细胞短期生存问题，重要的因素是渗解决培养细胞短期生存问题，重要的因素是渗透压。透压。v用于培养细胞的培养基的渗透压必须接近或等用于培养细胞的培养基的渗透压必须接近或等于细胞本身的渗透压，即等渗溶液。否则细胞于细胞本身的渗透压，即等渗溶液。否则细胞就会失水皱缩或吸水膨胀而死亡。就会失水皱缩或

43、吸水膨胀而死亡。v等渗溶液主要是通过培养基内无机盐中的各种等渗溶液主要是通过培养基内无机盐中的各种离子来实现的。离子来实现的。配制动物细胞培养基的无机盐与植物细胞的很不相同配制动物细胞培养基的无机盐与植物细胞的很不相同vNHNH4 4+ +对动物细胞是有毒的，但它却是植物细胞必需的对动物细胞是有毒的，但它却是植物细胞必需的氮源；氮源；vKClKCl和和NaClNaCl在动物细胞培养基中含量都较高，但它们在动物细胞培养基中含量都较高，但它们对植物细胞的生长却似乎并不重要。对植物细胞的生长却似乎并不重要。v动物细胞以高氧化态的动物细胞以高氧化态的FeFe3+3+（硝酸铁）为铁源，而植硝酸铁）为铁源

44、，而植物细胞以物细胞以FeFe2+2+（硫酸亚铁）为铁源。硫酸亚铁）为铁源。 微量元素微量元素v缺乏稀有微量元素的培养基对任何真核细缺乏稀有微量元素的培养基对任何真核细胞的培养都是不合适的。胞的培养都是不合适的。v培养基中微量元素的含量通常都很低，一培养基中微量元素的含量通常都很低，一般小于般小于1 1 g/Lg/L，水和无机盐中已有足够量，水和无机盐中已有足够量，不需要另加。不需要另加。维生素维生素v动物细胞培养也需要维生素，而且动物动物细胞培养也需要维生素，而且动物细胞对维生素种类的要求通常比植物细细胞对维生素种类的要求通常比植物细胞要多一些。胞要多一些。 维生素维生素动物（动物（mg/L

45、 mg/L ）植物（植物（mg/L mg/L ）尼克酰胺尼克酰胺1 1-4-4-尼克酸尼克酸-0.50.5-1-1吡哆醇吡哆醇-0.50.5-1-1吡哆醛吡哆醛1 1-4-4-硫胺硫胺1 1-4-40.10.1-10-10核黄素核黄素0.10.40.10.4-维生素维生素B B12121.361.36-叶酸叶酸1.61.6-泛酸泛酸1.61.6-氯化胆碱氯化胆碱1.61.6-动植物细胞培养基中常用的维生素动植物细胞培养基中常用的维生素 维生素维生素缓冲系统缓冲系统v缓冲系统对维持培养基的缓冲系统对维持培养基的pHpH值是至关重要的。值是至关重要的。v动物细胞培养基的动物细胞培养基的pHpH值是

46、通过模拟血浆内天然值是通过模拟血浆内天然存在的存在的COCO2 2/NaHCO/NaHCO3 3系统来控制的。系统来控制的。缓冲系统缓冲系统v肺中肺中:空气中空气中O2扩散到血液中，并与血红细胞结合。血浆扩散到血液中，并与血红细胞结合。血浆中中CO2扩散到空气中，被排出体外。扩散到空气中，被排出体外。v组织中：组织中：血红细胞释放携带的血红细胞释放携带的O2并扩散到组织细胞中，组织并扩散到组织细胞中，组织细胞呼吸产生的细胞呼吸产生的CO2被排放到血浆中。被排放到血浆中。v血浆中血浆中CO2的溶解与释放与形成的溶解与释放与形成H2CO3有关。有关。 v NaHCO3作为等渗溶液的一部分加到培养基

47、内。作为等渗溶液的一部分加到培养基内。临配制前加入，约临配制前加入，约2g/Lv 在密闭式培养瓶内，一方面，由于在密闭式培养瓶内，一方面，由于NaHCO3不不稳定，易分解产生稳定，易分解产生CO2，CO2从培养液中游离从培养液中游离出来，使培养液出来，使培养液pH值升高；另一方面，细胞值升高；另一方面，细胞呼吸产生的呼吸产生的CO2，以及细胞代谢产生的酸性代以及细胞代谢产生的酸性代谢产物，又使培养液谢产物，又使培养液pH值降低。值降低。 培养基颜色的变化培养基颜色的变化v在培养开始的时候，培养基的在培养开始的时候，培养基的pHpH值可能会明显上值可能会明显上升，但随着细胞的生长和细胞数目的增多

48、，培养升，但随着细胞的生长和细胞数目的增多，培养基的基的pHpH值就会逐渐降低。值就会逐渐降低。v酚红作为酚红作为pHpH指示剂：指示剂：培养基的颜色变化是：樱桃红色培养基的颜色变化是：樱桃红色 粉红色粉红色 黄色。黄色。v在使用培养基之前，先通入在使用培养基之前，先通入COCO2 2；或在或在COCO2 2培培养箱内，开放式培养的话养箱内，开放式培养的话v培养基的颜色变化则是：培养基的颜色变化则是：樱桃红色樱桃红色 黄色黄色pHv动物细胞对动物细胞对pHpH的稳定性要求较高，的稳定性要求较高，6.8-6.8-7.67.6。植物细胞则要求不高。植物细胞则要求不高。v一般通过改变培养基中的磷酸盐

49、或碳酸盐一般通过改变培养基中的磷酸盐或碳酸盐的比例来达到一定的的比例来达到一定的pHpH值。值。能源和碳源能源和碳源v葡萄糖葡萄糖(1(1-4g/L)-4g/L)是动物细胞的主要碳源。是动物细胞的主要碳源。v丙酮酸、琥珀酸和肌酸等碳源也常常成为动物丙酮酸、琥珀酸和肌酸等碳源也常常成为动物细胞的补充能源。细胞的补充能源。v当不要求培养细胞以最大速度生长时，可以用当不要求培养细胞以最大速度生长时，可以用半乳糖代替葡萄糖。半乳糖代替葡萄糖。 能源和碳源能源和碳源v植物细胞的能源包括蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、植物细胞的能源包括蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖和淀粉。海藻糖和淀粉。v蔗糖不能直接穿过细胞

50、壁进入细胞内被利用，但蔗糖不能直接穿过细胞壁进入细胞内被利用，但植物的细胞壁内含有蔗糖酶（植物的细胞壁内含有蔗糖酶（invertaseinvertase），），它它能把蔗糖水解为葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖再能把蔗糖水解为葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖再穿膜进入细胞内被利用。穿膜进入细胞内被利用。氮氮 源源动物细胞合成蛋白质和核酸的氮源有两种：动物细胞合成蛋白质和核酸的氮源有两种：成分明确的氮源成分明确的氮源 指动物细胞合成蛋白质和生长所指动物细胞合成蛋白质和生长所必不可少的一些必需氨基酸和非必需氨基酸。必不可少的一些必需氨基酸和非必需氨基酸。 成分不明确的氮源成分不明确的氮源 指动物细胞培养基中加

51、入的各种指动物细胞培养基中加入的各种动物血清、组织提取液以及蛋白水解产物（如水解动物血清、组织提取液以及蛋白水解产物（如水解乳蛋白）等。乳蛋白）等。血清（血清（serumserum）v血清是大多数生长培养基的一个成分。血清是大多数生长培养基的一个成分。v最常用的是牛血清，但马最常用的是牛血清，但马、人、兔及其他来源的人、兔及其他来源的血清有时也用。血清有时也用。v一般来讲，动物愈年轻，其血清愈有利于细胞生一般来讲，动物愈年轻，其血清愈有利于细胞生长。所以成年牛血清不如小牛血清长。所以成年牛血清不如小牛血清，小牛血清不小牛血清不如胎牛血清（如胎牛血清（fetal bovine serumfeta

52、l bovine serum）。血清（血清（serum）v血清中已知的贴壁和铺展因子有：血清中已知的贴壁和铺展因子有： 纤粘蛋白（纤粘蛋白（fibronectin） 冷不溶球蛋白（冷不溶球蛋白（cold-insoluble globulin，CIG） 血清铺展因子（血清铺展因子（serum spreading factor，SSF） 胎球蛋白胎球蛋白v目前尚不充分了解。目前尚不充分了解。v血清中含有多种细胞生长和增殖所必不可少的激素、血清中含有多种细胞生长和增殖所必不可少的激素、生长因子以及贴壁和铺展因子，其作用：生长因子以及贴壁和铺展因子，其作用： 血清和蛋白水解产物为培养细胞提供氮源。血清

53、和蛋白水解产物为培养细胞提供氮源。 具有促进细胞生长的能力。具有促进细胞生长的能力。 具有促进细胞在培养基质上附着和铺开的能力。具有促进细胞在培养基质上附着和铺开的能力。 抑制蛋白质水解酶活性的能力。抑制蛋白质水解酶活性的能力。血清对蛋白质水解酶活性的抑制作用：血清对蛋白质水解酶活性的抑制作用：可以保护体外培养细胞不受死细胞所可以保护体外培养细胞不受死细胞所释放的蛋白酶的伤害，释放的蛋白酶的伤害， 抑制传代时所用胰蛋白酶的消化作用，抑制传代时所用胰蛋白酶的消化作用，简化传代过程。简化传代过程。血清对培养细胞的不良影响血清对培养细胞的不良影响vA A、血清中存在一些不利于细胞生长和繁殖的物质，血

54、清中存在一些不利于细胞生长和繁殖的物质，如补体、免疫球蛋白、病毒、支原体和一些生长抑如补体、免疫球蛋白、病毒、支原体和一些生长抑制因子等；制因子等；vB B、血清的成分不明确，影响对结果的分析；血清的成分不明确，影响对结果的分析；vC C、不同动物、不同批次血清的成分和活性差异较大，不同动物、不同批次血清的成分和活性差异较大，使培养结果不稳定，实验重复性差。使培养结果不稳定，实验重复性差。v血清的灭活处理（灭活补体成分）：血清解冻后，血清的灭活处理（灭活补体成分）：血清解冻后，于于5656水浴水浴3030minmin。灭活后的血清其促生长能力有所灭活后的血清其促生长能力有所减弱，但可以在减弱，

55、但可以在44保存很长时间。保存很长时间。激素和生长因子激素和生长因子v激素和生长因子都是培养动物细胞生长和增殖必激素和生长因子都是培养动物细胞生长和增殖必不可少的物质。二者的功能有时很难严格区分。不可少的物质。二者的功能有时很难严格区分。添加剂添加剂微生物污染是细胞培养失败的一个重要原因，因此微生物污染是细胞培养失败的一个重要原因，因此培养基中常常要加入一定量的抗生素，减少污染的培养基中常常要加入一定量的抗生素，减少污染的机会。但是需要注意的是，抗生素只能抑制而不能机会。但是需要注意的是，抗生素只能抑制而不能消灭微生物，因而对于已建立的细胞系，应尽量少消灭微生物，因而对于已建立的细胞系，应尽量

56、少用或经常停用抗生素，以便使可能的低度微生物污用或经常停用抗生素，以便使可能的低度微生物污染及时得到暴露。染及时得到暴露。 （二）培养基的制备1 1、天然培养基、天然培养基 v血清血清v水解乳蛋白水解乳蛋白v胚胎浸出液（胎汁）胚胎浸出液（胎汁）v胶原胶原血清血清v基本制备过程：无菌条件下取血，然后将盛血的小瓶基本制备过程：无菌条件下取血，然后将盛血的小瓶或试管倾斜，室温放置或试管倾斜，室温放置2 2-4h-4h，待血液充分凝结后，移待血液充分凝结后，移入入44冰箱过夜，让血清析出。次日，吸取析出的血冰箱过夜，让血清析出。次日，吸取析出的血清（淡黄色），清（淡黄色），4000 4000 rpmr

57、pm离心离心10 10 minmin，收集上清液，收集上清液，过滤除菌后分装保存于过滤除菌后分装保存于-20-20。v自制血清应进行质量检测，保证无细菌、真菌、支原自制血清应进行质量检测，保证无细菌、真菌、支原体和病毒污染，且球蛋白含量不超过体和病毒污染，且球蛋白含量不超过0.20.2g/Lg/L。若球蛋若球蛋白含量过高，表明胎牛或孕牛患有感染性疾病。因此，白含量过高，表明胎牛或孕牛患有感染性疾病。因此，球蛋白含量越低的血清，其质量越好。球蛋白含量越低的血清，其质量越好。 水解乳蛋白水解乳蛋白LHv水解乳蛋白是乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解后的产水解乳蛋白是乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解后的产物，含有

58、丰富的氨基酸。物，含有丰富的氨基酸。v可用于许多细胞系和原代细胞的培养，是常用的天可用于许多细胞系和原代细胞的培养，是常用的天然培养基。然培养基。v使用时，用使用时，用HanksHanks液配制成液配制成0.5%0.5%的酸性溶液，然的酸性溶液，然后与合成培养基以一定比例混合使用（一般为后与合成培养基以一定比例混合使用（一般为1:11:1的体积比）。的体积比）。v商品化的水解乳蛋白为淡黄色粉末，易潮解结块，商品化的水解乳蛋白为淡黄色粉末，易潮解结块，但不影响使用。不同商家和不同批次的水解乳蛋白但不影响使用。不同商家和不同批次的水解乳蛋白质量有所差异。质量有所差异。 胚胎提取液胚胎提取液v是早期

59、细胞培养中应用的天然培养基。是早期细胞培养中应用的天然培养基。v主要成分是一些大分子蛋白和小分子氨基酸，能主要成分是一些大分子蛋白和小分子氨基酸，能促进细胞生长繁殖。促进细胞生长繁殖。v常用鸡胚浸出液和牛胚浸出液。常用鸡胚浸出液和牛胚浸出液。v鸡胚浸出液的制备方法是：将鸡胚浸出液的制备方法是：将9 9-10d-10d胎龄的鸡胚胎龄的鸡胚磨碎，加等量缓冲液，离心收集上清，保存于磨碎，加等量缓冲液，离心收集上清，保存于- -2020。 胶原（胶原（collagen）v作用：为了促进组织块或细胞的贴壁生长能力作用：为了促进组织块或细胞的贴壁生长能力。v来源：大鼠尾腱、豚鼠和牛的真皮以及牛眼的水晶来源

60、：大鼠尾腱、豚鼠和牛的真皮以及牛眼的水晶体等。体等。v实验室大鼠尾腱制备方法：无菌条件下，取大鼠的实验室大鼠尾腱制备方法：无菌条件下，取大鼠的尾腱，剪碎，用尾腱，剪碎，用0.1%0.1%醋酸溶液醋酸溶液44浸泡浸泡48 48 h h后，后，4000 4000 r/min r/min 离心离心30 30 minmin，取上清分装保存于取上清分装保存于-20-20。v使用：将胶原均匀涂布于培养瓶的细胞生长面上，使用：将胶原均匀涂布于培养瓶的细胞生长面上，然后用沾有氨水的消毒棉球塞住瓶口，置密闭容器然后用沾有氨水的消毒棉球塞住瓶口，置密闭容器中室温作用中室温作用2 2 h h，氨气与胶原作用，使胶原凝固