分子生物学实验设计

1、基于基于LSU基因和基因和SSU基因的基因的广义美味牛肝菌系统发育研究广义美味牛肝菌系统发育研究 姓名：李静娴 专业：生物工程 导师：马绍宾 学号：12015002274一、研究背景一、研究背景二、研究目的及意义二、研究目的及意义三、实验设计三、实验设计四、数据分析四、数据分析核糖体 DNA ( ribos omal DNA, r DNA)是国际上公认的生物各类群各分类水平比较研究的一个很好的分子指标 ,它是一类中等重复的 DNA序列 ,每个重复单位都由非转录间隔区、 转录间隔区和 3种 RNA ( 18SRNA, 5 . 8S RNA)基因编码组成.核糖体 DNA在细胞中以一种协同方式进化

2、,在个体和群体内有着较好的均质性 ,因此个体的 rDNA通常具有种代表性 ,即少量个体的抽样亦能有效地代表其来源群体的 DNA变异情况。目前,核糖体 DNA的转录间隔区 ITS区、 大亚基片断 LSU r DNA (即 28S RNA )以及小亚基片断SS U r DNA (即 18S RNA)等基因在原核生物研究中得到了广泛、 有效地应用，但在大型真菌鉴定中的应用较少。其中 LSU r DNA虽然较 ITS区保守 ,但它较 SSU r DNA变异高 ,是一段由保守区与高变区相互镶嵌的 DNA片段,适合从种到属的分类鉴定。一、研究概况一、研究概况云南省具有复杂的地形地貌和特殊的气候条件以及多种

3、多样的森林类型和土壤种类。在这样得天独厚的自然生态条件下，孕育了丰富多彩的食用菌资源。云南的野生食用菌加上人工栽培种类食用菌有800种左右，食用菌种类约占世界的约40%，占全国的85.3%左右；绝大多数属于口蘑科、牛肝菌科、红菇科、蘑菇科、裂褶菌科、多孔菌科、珊瑚菌科和丝膜菌科等类群。其中牛肝菌类是云南市场上最为重要的食用菌。牛肝菌类有近40钟常见食用菌，主要分布有9属：牛肝菌属、疣柄牛肝菌属、绒盖牛肝菌属、圆孔牛肝菌属、小牛肝菌属、粉孢牛肝菌属、褶孔牛肝菌属、乳牛肝菌属和粉末牛肝菌属。滇中市场上以牛肝菌属为主，占总贸易量至少70%。牛肝菌类以美味牛肝菌、黑牛肝菌、褐疣柄牛肝菌最为常见,同时美

4、味牛肝菌也是国际著名的食用菌,在欧洲国家深受欢迎,是出口创汇的重要种类之一。一、研究概况一、研究概况在云南，可食用的牛肝菌主要根据子实体的颜色被通俗地分为“白牛肝”，“黄牛肝”和“黑牛肝”，其中“白牛肝”即实际分类学上的“美味牛肝菌”在贸易中占有重要的地位。从分类学上看，广义的美味牛肝菌复合群包括以下5个种:美味牛肝菌(Boletus edulis Ball.ex Fr)、褐红牛肝菌(B.pinophilus Pilt & Dermek)、铜色牛肝菌(B.aereus Ball.ex Fr)、网纹牛肝菌(B.Reticulates Schaeff)和夏生牛肝菌(B.aestivalis

5、(Paul.)Fr)这5个种。二、研究目的及意义二、研究目的及意义牛肝菌科(Boletaceae)真菌具有重要的生态和经济价值。云南省是美味牛肝菌最重要的主产区，但是由于近年来不合理的采收、生存环境的破坏以及人工栽培技术的滞后，使美味牛肝菌呈现出产量日益减少。要发展和壮大我国牛肝菌产业，使资源得到可持续利用，正确认识物种及其生物学特性是进行研究工作的基础。目前针对牛肝菌属进行的分子系统学研究，多采用多个基因（34个）。综合利用多个基因序列、形态特征及生态特征进行联合系统发育分析，可得到较为准确的能反映牛肝菌属的种类多样性状况及系统发育关系的结果。基于LSU和SSU的系统发育分析，国外和国内都很

6、少有报道。本研究试图选取牛肝菌科中的广义美味牛肝菌属，选用LSU和SSU分析构建系统树。研究的主要目的一是分析牛肝菌的类群划分及类群下已知种间的关系，为羊广义美味牛肝菌菌属系统发育提供详实的分子证据。三、实验设计三、实验设计3.1实验材料实验材料在野外调查时采集研究材料，新鲜牛肝菌采集后用硅胶干燥或自然风干后备用。3.2实验仪器实验仪器电子天平；水浴箱；常温超速离心机；北京六一仪器厂电泳槽；Bio Rad电泳仪；WD-9403F型手持紫外分析仪；GE9700 PCR仪；Beckman UV640型紫外分光光度计；Gensnap凝胶成像仪。3.3实验试剂实验试剂1CTAB DNA提取液；TE缓冲

7、液；氯仿；苯酚；异戊醇；异丙醇；-巯基乙醇；乙酸钠；70%乙醇；76%乙醇；核酸染料；上样缓冲液（含0.25%溴酚蓝，40%蔗糖）；dNTP；DL2000Marker；DL5000Marker； MgCl2；10Buffer；TapDNA聚合酶；NS1/NS8引物；LROR/LR5引物。试验流程：试验流程： LSU和和SSU序列扩增序列扩增引物设计引物设计样品采集，编号样品采集，编号检测检测DNA浓度及浓度及纯度纯度CTAB法提取样品法提取样品DNAPCR扩增扩增PCR体系体系参数的优参数的优化化DNA检测及检测及琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶DNA的回收的回收测序测序3.4DNA提取提取采用改良的CT

8、AB法提取牛肝菌基因组DNA。称取0.12g左右的干燥样品，加入液氮后研磨至粉状，迅速加入-CTAB500l，混匀后置移至1.5mL离心管中，65水浴振荡抽提60min；冷却后加入300l的氯仿和等体积的Tris饱和酚，混匀后65000r离心30min；重复步骤 一次；取上清，先加入1000l 无水乙醇，混匀，放入-20冰箱中沉淀1h或者过夜；取出，12000r离心10min，弃上清液，沉淀依次用1000l 75%乙醇洗涤两次，每次10000r离心2min，后弃上清、风干 ；加入50l TE缓冲液或去离子水溶解，4冰箱保存。3.5DNA纯度及浓度检测纯度及浓度检测原来是使用紫外分光光度计测定波

9、长在230nm、260nm、280nm处的OD值，根据260nm处的OD值计算DNA浓度，根据260/280、260/230值确定DNA的纯度。现在可用核酸蛋白仪测定提取的DNA的浓度和纯度。3.6LSU和和SSU序列扩增引物序列扩增引物使用NCBI或其他引物设计软件设计特异性引物。具体实验步骤：具体实验步骤：具体实验步骤：具体实验步骤：3.7.1PCR体系参数的优化体系参数的优化PCR扩增体系中，Taq酶用量、镁离子浓度、dNTP、引物及模板浓度及退火温度均会对扩增结果产生影响，其中扩增模板浓度与退火温度对其影响最大，直接关系到扩增产物的多少和有无。采用正交实验设计方法，以Taq酶浓度、镁离

10、子浓度、dNTP浓度、引物浓度四种因素，取A、B、C 3种水平，见表2，对PCR反应体系进行优化。具体实验步骤：具体实验步骤：根据上面的因素及其水平的设计，进行4因素3水平正交试验，即L9（34），9个处理结果存在明显差异（见图1），并根据这9中处理结果分析正交试验极差分析（见表3）。据ki值大小可知，各因素优化水平组合为：TaqDNApolymerase 2U，Mg2+ 2.0 mmolL1，Primer 0.4molL1，dNTP 0.2 mmolL1 。具体实验步骤：具体实验步骤：3.7.2模板浓度的确定模板浓度的确定扩增产物电泳检测：取PCR产物5l，上样缓冲液（含0.25%溴酚蓝，4

11、0%蔗糖）3l，混匀，点入含0.5g/ml溴化乙锭（2l）的1 %琼脂糖凝胶中，点入DL2000 Marker，用1TAE缓冲液，80V电压电泳80min，于紫外检测仪下观察，条带清晰度，并比较以确定牛肝菌LSU和SSU-PCR中模板的最佳浓度。3.7.3最佳退火温度的确定最佳退火温度的确定分别设定LSU和SSU退火温度，并对扩增产物电泳检测：取PCR产物5l，上样缓冲液2l，混匀，点入含0.75l核酸染料的1.8%琼脂糖凝胶中，点入DL2000 Marker，用1TAE缓冲液，80V电压下电泳80min，于紫外检测仪下观察条带。因此确定牛肝菌LSU-PCR中最佳退火温度和SSU-PCR中最佳

12、退火温度。综合以上综合以上PCR体系参数的优化，可的得出最优反应条件体系参数的优化，可的得出最优反应条件具体实验步骤：具体实验步骤：3.7.4DNA检测检测1.取0.1g琼脂糖加入100mL电解液中溶解，放入微波炉中加热30s，重复此步骤直到溶液澄清（一般2次）左右，后取出，等溶液冷却至5060左右；2.取核酸染料滴入上述缓冲液（5滴），导入电泳槽中，插入梳子，等其冷却至凝固后拔出梳子；3.点样：取溴酚蓝2uL与5uL的DNA样品混合；4.80V电压下电泳2030min;5.电泳结束后取出凝胶，在紫外灯下检测。具体实验步骤：具体实验步骤：3.7.5琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶DNA的回收的回收回收的步

13、骤如下：在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽量切掉不含DNA的凝胶。先秤取空的1.5ml的离心管的重量，然后将切下含有DNA条带的凝胶放入1.5ml离心管中秤重，两次秤得的重量相减便是凝胶的重量。向1.5ml的离心管中加入600l的凝胶/结合液DB。56水浴放置10min直到凝胶完全溶解，并且每2-3min斡旋振荡一次帮助凝胶加速溶解。加入150l的异丙醇，并振荡混匀。将步骤获得的溶液加入到吸附柱AC中，并将吸附柱放入到收集管中，在12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液加入700l漂洗液WB，12000rpm离心1min，弃掉废液。加入500l漂洗液WB，12000rpm离心1min，弃掉废液，重复一次。12000rpm下