荧光偏振免疫分析上课讲义

1、荧光偏振免疫分析最具代表性的两种技术最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术酶放大免疫测定技术EMITEMITenzyme-mutiplied immunoassay technique克隆酶供体免疫分析克隆酶供体免疫分析 CEDIACEDIAcloned enzyme donor immunoassay 酶放大免疫测定技术酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutiplied immunoassay techniquel酶：磷酸葡萄糖脱氢酶（）l底物： 磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖 磷酸葡萄糖酸 辅酶（） 还原型辅酶（）340nm处最大吸收峰克隆酶供体免疫分析克隆酶供体免疫分析 CEDIAclon

2、ed enzyme donor immunoassay荧光偏振免疫测定荧光偏振免疫测定(fluorescence polarization immunoassay，FPIA) 荧光抗体技术荧光抗体技术:检测组织或细胞中抗原 时间分辨荧光免疫测定 荧光免疫测定分析技术荧光免疫测定分析技术： 检测体液中微量物质 荧光偏振免疫测定荧光偏振免疫测定(FPIA)(FPIA) 荧光免疫分析法荧光免疫分析法 荧光偏振免疫测定荧光偏振免疫测定(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)，为一种均相荧光免疫测为一种均相荧光免疫测定方法，其利用荧光物质在溶液中被单一平面

3、的定方法，其利用荧光物质在溶液中被单一平面的偏振光照射后，可吸收光能而产生另一单一平面偏振光照射后，可吸收光能而产生另一单一平面的偏振发射荧光，该荧光强度与荧光的偏振发射荧光，该荧光强度与荧光 标记物质在标记物质在溶液中旋转的速度与分子大小呈反比，常采用抗溶液中旋转的速度与分子大小呈反比，常采用抗原原-抗体竞争反应原理，适用于小分子半抗原（如抗体竞争反应原理，适用于小分子半抗原（如药物浓度）的检测。药物浓度）的检测。定义：定义：原理：原理：光的本质是电滋波，光是各个方向电滋波的混合光的本质是电滋波，光是各个方向电滋波的混合物，当光线通过偏振滤光片后，形成只有一个方物，当光线通过偏振滤光片后，形

4、成只有一个方向的电滋波，称之为偏振光。荧光物质经单一平向的电滋波，称之为偏振光。荧光物质经单一平面的偏振光（蓝色光，面的偏振光（蓝色光，485nm）激发后，可吸收）激发后，可吸收光能跃入激发态，在其恢复至基态时，释放能量光能跃入激发态，在其恢复至基态时，释放能量并发射出单一平面的偏振荧光（绿色光，并发射出单一平面的偏振荧光（绿色光，525nm550nm） 。485nm偏振光485nm偏振光产生强偏振荧光产生偏振荧光吗？产生偏振荧光吗？ 荧光偏振免疫分析的特征：荧光偏振免疫分析的特征：AgAgF F分子小，转动速度快，偏振荧光弱分子小，转动速度快，偏振荧光弱; ; AgAgF F-Ab-Ab分子

5、大，转动速度慢，偏振荧光强分子大，转动速度慢，偏振荧光强; ; 若待检抗原多，则若待检抗原多，则AgAgF F-Ab-Ab少，少，AgAgF F多，偏振多，偏振荧光弱荧光弱; ;待检抗原含量与偏振荧光强度成反比。待检抗原含量与偏振荧光强度成反比。485nm偏振光FPIA的评价：的评价：l操作简便：避免多次洗涤步骤；l快速：各物质混匀，孵育数分钟后即可测定；l环保；l有颜色和浑浊的溶液不干扰检测结果。产品(台数)Mar. 2003Abbott AxSYM/ i2000/i2000srBayerCentaur/ACS180BeckmanAccess/Access 2DPCImmulite/Immu

6、lite 2000/100J & JVitros ECiRoche2010/1010/E170美国4000+/100+/100+800/7001500/250-/-/100-600/200/50非美国15000+/1200+/1200+2000/20002500/1255000/2000/20010004000/2000/300Source: Information Dynamics 2000目前在AxSYM上可提供的项目有超过8080项使用的技术有MEIAMEIA, , FPIAFPIA, Ion Capture, Ion Capture和REAREA肝炎肝炎/爱滋爱滋甲肝抗体-IgM甲肝抗

7、体甲肝抗体(定量)乙肝表面抗原确证乙肝表面抗原乙肝表面抗体(定量)乙肝核心抗体乙肝核心抗体-IgM乙肝e抗原乙肝e抗原(定量)乙肝e抗体丙肝抗体(第三代)爱滋抗体艾滋抗原/抗体先天性疾病先天性疾病风疹病毒-IgG风疹病毒-IgM弓形体-IgG弓形体-IgM巨细胞病毒-IgG巨细胞病毒-IgM肿瘤标志物肿瘤标志物甲胎蛋白癌胚抗原前列腺特异性抗原糖类抗原125糖类抗原153糖类抗原199游离前列腺特异性抗原总前列腺特异性抗原B-2微球蛋白Pepsinogen/甲状腺功能甲状腺功能三碘甲状腺原氨酸甲状腺素游离三碘甲状腺原氨酸游离甲状腺素超敏促甲状腺素促甲状腺素 3.0甲状腺摄取抗-TPO抗-TgPT

8、H生殖生殖/内分泌内分泌总B人绒毛膜促性腺激素促黄体生成素促卵泡生成素雌二醇孕酮催乳素睾酮心血管急诊心血管急诊肌酸激酶(MASS)心肌钙蛋白-I心肌红蛋白同型胱胺酸酸BNP代谢代谢铁蛋白胰岛素B12叶酸考的松治疗药物治疗药物地高辛茶碱普鲁卡因乙酰普鲁卡因酰胺奎尼丁卡马西平苯巴比妥丙戊酸洋地黄妥布霉素庆大霉素万古霉素环孢霉素滥用药物滥用药物苯妥英钠酒精三环类抗抑郁药醚沙酮安菲他明天使尘巴比妥类药物安定水杨酸盐药物可卡因鸦片类AMP/METH大麻类药物80余项余项系统控制中心系统控制中心纤维杯容器纤维杯容器样品中心样品中心运行中心运行中心供应中心供应中心l样品/测试放置清单l结果浏览l报告/选择结

9、果l动态时间显示和批处理结果l病人结果打印l结果保存和归档l定标浏览lLevey Jennings 质控图l库存监控l自动 “菜单操做保养”l帮助屏幕玻璃纤维杯用于MEIA方法的微粒子捕捉通过仪器上的纤维杯容器自动排放可一次放置250个纤维杯用于MEIA方法的分析可连续放置，纤维杯的放置可任意方向特性：特性：表面玻璃纤维网中间强力吸水棉特制的分离杯，使固液相分离，立体冲洗彻底，大大提高了反应的特异性自动开盖器l样品转盘 由6个样品架组成，可放置90 个原试管/血清管/样品杯.在系统中可连续加样急诊项目少于11分钟出结果条码可识别样品架和样品管 可条形码识别样品和样品架位置，便于联网和避免人为误

10、放位置l试剂转盘 可放置20个试剂盒，每盒100测试总计2000上机测试试剂试剂可在仪器上连续放置336小时上机试剂可连续放置特性：特性：试剂盒独立包装，无须配置仪器自动开盖，避免蒸发和污染条形码自动识别种类和位置试剂盒有优秀的稳定性l反应杯转盘可放置90个反应杯并可随时补充反应杯可随时加入而不需按暂停系统操作KittingKitting技术技术不同的分析项目有：不同原理(FPIA,ICIA)不同方法(夹心法，竞争法)不同步骤(1步法，2步法，3步法)不同反应时间和清洗量将大包装试剂，样品分装到每个RV反应杯中，分析软件来控制整个反应过程，获得最完美地测试结果特殊的清洗站特殊的清洗站特殊的探针

11、特殊的探针特殊的注射器特殊的注射器光路系统光路系统lKitting运行步骤此步骤将样品和所需试剂加入反应杯反应杯被送入运行中心转盘进行余下步骤的操作l运行转盘FPIA法的清洗，反应和读数在此转盘进行。此转盘含有36个位置。一旦MEIA分样步骤完成,样品被放入纤维杯，在纤维杯转盘进行清洗，加入底物，读数，所有的MEIA分析在此进行，此转盘含有32个位置分析结束后反应杯和纤维杯被自动扔入固体废物箱l库存的管理上机的大瓶试剂为通用试剂,例如:MUP,离子液,MEIA缓冲液/微粒子洗液, FPIA缓冲液/洗液系统控制中心对库存进行跟踪和更新l废物的管理分为液体和固体废物，十分容易的废物处理可直接进行废

12、液的排放上机可维持8小时特性：特性：半定量：单点Index定标定量：2点Master和6点Standard定标多种选择，标准曲线稳定时间长，同时可保存4个不同批号标准曲线，节省试剂,无须配置特点：特点：半定量：阴，阳性质控定量：高，中，低质控多项质控可供应全面的质控配套，稳定的质控可作为动态跟踪的依据，L-J质控图可全面监控系统和试剂状态，无须配置简单三步,仪器自动完成所有工作开启电源：5-8分钟自检进入主菜单启动：选择主菜单F3-STARTUP READY状态清除固体和液体废物和更新记录更新库存纤维杯库存更新仪器的启动仪器的启动仪器的启动仪器的启动1,2,3,号缓冲液更新冲洗管路探针内部清洗

13、样品检测仪器的关闭仪器的关闭探针内部清洗关机探针外部清洗冲洗站清洗1,号注液器清洗清洁过滤网每周保养每周保养FPIA和MEIA的光路检查清洁样品篮和样品管托架清洁运行中心转盘和纤维杯转盘每周保养每周保养l双向选择能力-为将来扩充为LAS系统提供平台l读条码能力-避免人为误放,可随意放置样品和试剂l自动稀释功能-可成批,任意和单独选择,扩展可检出范围l自动转测功能-为临床诊断提供更多依据,并减少病人负担l自动重测功能-避免错误结果l触摸式屏幕-提供更方便的操作模式l试剂,消耗品,废物跟踪-了如执掌,随时添加l随时添加试剂,消耗品-保证仪器可连续运行l试剂盒自动开盖-避免试剂蒸发和交叉污染,提供更

14、可靠结果l试剂自动振荡混匀-防止试剂不均l试剂自动切换-节省试剂,使用方便l定标点数-1点,2点和6点,多种选择,节省试剂l储存标准曲线数量-4条不同批号,前后交接,避免浪费l试剂前处理步骤-无,节省劳力,避免误差l质控-每日监控, L-J质控图可全面监控系统和试剂状态l清洗模式-按项目的不同选择不同的冲洗模式以达到最佳冲洗效果l清洗方式-磷酸缓冲液清洗内部结构设计为最大剪切力的探针清洗,特殊清洗站设计使探针内外壁清洗l携带率表现-6106 IU/L -HCG交叉测定于阴性标本时携带率1IU/L,2g/L 重组HBsAg交叉测定于阴性标本时携带率0.1g/Ll每日维护保养时间3分钟仪器自动完成

15、l稳定性:l标准曲线稳定时间-同一批号的试剂l试剂开启后稳定时间-28尽效期l试剂可否长期上机-可以,且无冰箱l试剂有效期-一般至少6个月,最长可达1年l精密度-按NCCLS的EP5-T2标准小于5%CVl灵敏度-极佳的灵敏度,HBsAg可测0.17ng/ml, hTSH()功能灵敏度可达0.01IU/mll快速之检测能力-每小时80120个测试,出结果时间8 30分钟l灵活之分析模式-可随机,连续和急诊取样l弹性之工作流程-可按实验室的自然工作流程l公认之技术原理-MEIA,FPIA和ICIA技术l广泛之检测项目-肝炎,爱滋,肿瘤,性激素,甲状腺,代谢类,先天性疾病,药物,毒品等l正确之实验结果-通过美国FDA标准,中国SFDA证书l容易之功能操作-简单三步,每个人都会使用l简单之仪