MALDI-TOF-MS技术及应用

1、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS）技术）技术20022002年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖发展了对生物大分子进行鉴定和结构分析的方法，建发展了对生物大分子进行鉴定和结构分析的方法，建立了软解析电离法对生物大分子进行质谱分析立了软解析电离法对生物大分子进行质谱分析田中耕一田中耕一【日日】约翰约翰贝内特贝内特芬恩芬恩【美美】MALDIMALDI技术技术离子化技术：离子化技术：MALDIMALDIMatrix-Assisted Laser Desorption/ IonizationMALDIMALDI技术的原理技术的原

2、理样品与基质，在样品靶表面形成的共结晶薄膜激光照射，基质吸收能量基质把能量传递给样品分子，将电荷转移给样品，样品电离。质谱分析原理质谱分析原理进样系统进样系统离子源离子源质量分析器质量分析器检测器检测器1.气体扩散2.直接进样3.色谱1.电子轰击2.化学电离3.场致电离 4.激光 1.单聚焦 2.双聚焦 3.飞行时间4.四极杆 基质辅助激光解吸电离基质辅助激光解吸电离(MALDI)(MALDI)常用基质：常用基质： 芥子酸(3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)（SA)、龙胆酸(2,5-二羟基苯甲酸)(DHB)、-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、吡啶甲酸(PA)、3-羟基吡啶甲酸(3HPA)。M

3、ALDIMALDI技术中基质的作用技术中基质的作用l把样品分子彼此分开(基质：样品=10，000：1)，削弱样品分子之间的相互作用。l基质吸收激光的能量，并将部分能量传递给样品。l帮助样品离子化。基质是如何帮助样品分子电离的？以正离子模式为例： 基质吸收激光的紫外波长后增加能量，並将能量部分释放给样品分子 帮助样品分子质子化，並帶有电荷（M+H+） M+H+ 在真空状态下，雾化形成气态单一分子。在高压电场的吸引下M+H+ 离开离子源飞向飞行管Matrix - CHCA常用基质及选择基质样品HCCA蛋白，多肽，糖，小分子，极性聚合物DHB蛋白，多肽，糖，小分子，极性聚合物HPA核苷酸Dithra

4、nol非极性聚合物IAA非极性聚合物E=Uz=1/2mvE=Uz=1/2mv2 2 和和 t=t=L/VL/V E E：离子在加速电场获得的动能离子在加速电场获得的动能; ; UU：加速电场电压加速电场电压z z：离子所带电荷离子所带电荷; ; mm：离子质量离子质量v v：离子飞行速度离子飞行速度; ; L L：飞行管道长度飞行管道长度t t：离子飞行时间离子飞行时间; ; c c：常数常数 质量分析范围：质量分析范围：500500Da-100KDaDa-100KDaMALDI-TOF质谱的原理t = c m/zPulsed laser3.多肽离子在多肽离子在TOF管里飞行，飞行速度管里飞行

5、，飞行速度取决于多肽离子的取决于多肽离子的M/Z的大小的大小 Flight tube1：基质与多肽样本共同：基质与多肽样本共同置于刚靶上。置于刚靶上。High vacuumTimeHigh voltage2. 样本被激光电离形成多肽样本被激光电离形成多肽离子混合物离子混合物 。20 - 25 kV5. 检测到每个离子的检测到每个离子的M/Z后，同一张图谱上计算机输后，同一张图谱上计算机输出每个肽段出每个肽段M/Z，即蛋白质的多肽图谱，通过与理论，即蛋白质的多肽图谱，通过与理论数据库中的肽图片比对，从而鉴定蛋白。数据库中的肽图片比对，从而鉴定蛋白。4. 到达检测器的离到达检测器的离子，通过检测器

6、检子，通过检测器检测出每个肽段离子测出每个肽段离子的的M/Z.1.3 MALDI-TOF-MS质谱的分析步骤质谱的分析步骤LaserMALDI-TOF-MS线性模式检测SampleplateAnalytemolecules in matrixAccelerationgridsDrift tubeIon detectorMass spectrumVacuum systemVacuumlock几秒钟即可得到结果 MALDI-TOF MALDI-TOF 质谱的特点质谱的特点 软电离质谱碎片少 检测质量范围宽400kDa 灵敏度高 fmol 分析速度快自动化 数据容易解释 可以测试混合物 可以测试高分

7、子 仪器容易使用、维护triggerdiode laservariableattenuator250 l/sturbo250 l/sturbo3.4 m reflector1.8 m linearMALDI TOF MS的构成的构成检测器检测器1：线性模式：线性模式检测器检测器2：反射模式：反射模式线性模式和反射模式反射模式（linear）1. 一般测试分子量小于4000的样品2. 分辨率高，单同位素清晰准确线性模式（reflection）1. 一般测试大分子量样品（M4000）2. 分辨率低，得到是平均分子量的质荷比反射模式下反射模式下TOFTOF的分辨率高于线性模式的分辨率高于线性模式Br

8、uker公司仪器示意图ABI公司仪器示意图岛津公司仪器示意图DetectorHelium collision cell for fragmentgenerationIon gate forparent ionselectionPulsed LasergeneratesMALDI ions20 KeVMALDI IonSourceMALDI-TOF质谱的应用质谱的应用应用应用MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS技术技术鉴定和分类微生物鉴定和分类微生物待检样品克隆选择样品制备质谱分析数据分析菌种鉴定?Bacillus globigiiProfiling results from dif

9、ferent Bacillus strains -6000 -4000 -2000 0 2000 4000 6000a.i.B. globigiiB. licheniformisB. subtilisB. thuringiensis实验流程Result Report | Detected Species | Ranking |act Sc |max Sc |Rel Score |PN k |PN b |PN m |Rel P-Num.|I-Corr.|1000*Pro-Spectrum #12 | Ps. mendocina DSM50017 | 1 | 3813 | 4271 | 0.89

10、| 41 | 10 | 83 | 0.55 | 0.88 | 438 | Ps. oleovorans B396 | 2 | 1671 | 3450 | 0.48 | 14 | 8 | 83 | 0.22 | 0.39 | 41 | Ps. fluoreszens B340 | 3 | 868 | 4186 | 0.21 | 6 | 7 | 83 | 0.11 | 0.19 | 4 | Ps. veronii DSM11331 | 4 | 847 | 4250 | 0.20 | 5 | 7 | 83 | 0.10 | 0.14 | 3 | Ps. putida DSM291 | 5 | 374

11、 | 2821 | 0.13 | 3 | 3 | 83 | 0.05 | 0.12 | 1 | Ps. putida B401 | 6 | 329 | 2638 | 0.12 | 3 | 2 | 83 | 0.05 | 0.11 | 1基于谱图模式比对的细菌鉴定应用软件应用软件BIOTYPERBIOTYPER细细菌鉴定结果的报告菌鉴定结果的报告MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS技术鉴定微生物优势技术鉴定微生物优势l速度快速度快，操作简单，操作简单l结果不受生长培养基影结果不受生长培养基影响，结果不受细菌响，结果不受细菌生长状态影响生长状态影响l重复性重复性, ,稳定性好。稳定性好

12、。( (在标准条件下进行样在标准条件下进行样本制备和测量后，在不同的本制备和测量后，在不同的MALDI-TOFMALDI-TOF仪器仪器上获取的质谱谱图具有很高的可比性上获取的质谱谱图具有很高的可比性。) )l高通量，成本低。高通量，成本低。建立已知微生物的标准蛋白质组建立已知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库指纹质谱数据库l取得微生物标准品的单克隆取得微生物标准品的单克隆样品样品l样品进行样品进行MALDI-TOF MSMALDI-TOF MS分析分析得到标准品质谱得到标准品质谱l建立多种常规检测目标微生建立多种常规检测目标微生物质谱数据库物质谱数据库l未知样品通过未知样品通过MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS分析得到质谱分析得到质谱l未知样品质谱进入建立好的未知样品质谱进入建立好的质谱数据库进行比对质谱数