动物细胞工程高三生物一轮复习

1、2.2 动物细胞工程动物细胞工程植物细胞工程常用的技术植物细胞工程常用的技术动物细胞工程常用的技术动物细胞工程常用的技术植物组织培养植物组织培养植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞培养动物细胞培养核移植核移植动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体单克隆抗体 概念：就是从动物机体中取出相关的组织，概念：就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基上养基上, , 让这些细胞生长和增殖。让这些细胞生长和增殖。一一. 动物细胞培养动物细胞培养（一）过程（一）过程细胞贴壁细胞贴壁：培养贴附性细胞的时候，细胞要能够贴附于：培养贴附性细胞的时候，细

2、胞要能够贴附于底物上才能生长。底物上才能生长。接触抑制接触抑制：贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞：贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增长。就会停止分裂增长。原代培养原代培养：动物组织消化后的初次培养，包括培养的：动物组织消化后的初次培养，包括培养的第第一代与第十代以内的细胞。一代与第十代以内的细胞。传代培养传代培养：将原代培养的细胞从培养瓶中取出，配置成：将原代培养的细胞从培养瓶中取出，配置成细胞悬液，分装到两个以上的培养瓶中继续培养。细胞悬液，分装到两个以上的培养瓶中继续培养。细胞贴壁过程细胞贴壁过程细胞在贴壁生长过程细胞在贴壁生长过程中中, ,随着细胞分裂随着细胞分裂

3、, ,数数量不断增加量不断增加, ,最后形最后形成一个成一个单层单层, ,此时细此时细胞间胞间相互接触相互接触, ,细胞细胞分裂和生长停止。分裂和生长停止。接触抑制接触抑制单个细胞单个细胞剪碎剪碎 胰蛋白酶胰蛋白酶原代培养原代培养（分瓶前）（分瓶前）传代培养传代培养（分瓶后）（分瓶后）胚胎或幼龄动物的组织器官胚胎或幼龄动物的组织器官( (细胞来源细胞来源) )加培养液加培养液细胞悬浮液细胞悬浮液1010代细胞代细胞5050代细胞代细胞无限传代无限传代（二）动物细胞培养的条件：（二）动物细胞培养的条件：1.无菌无毒的环境无菌无毒的环境 无菌操作并加抗生素无菌操作并加抗生素2.2.营养营养葡萄糖葡

4、萄糖，氨基酸，无机盐，微量元素，氨基酸，无机盐，微量元素，动物血清动物血清3.3.温度和温度和PHPH与哺乳动物体温接近，与哺乳动物体温接近，PHPH为为7.2-7.47.2-7.44.4.气体环境气体环境O2O2和和CO2CO2定期更换培养液定期更换培养液（三）动物细胞培养的应用（三）动物细胞培养的应用生物制品：培养杂交瘤细胞获得病毒疫苗，干扰生物制品：培养杂交瘤细胞获得病毒疫苗，干扰素，单克隆抗体等生物制品。素，单克隆抗体等生物制品。检测有毒物质：有毒物质可以引起培养动物细胞检测有毒物质：有毒物质可以引起培养动物细胞畸形或病变。畸形或病变。理论研究：通过培养正常或各种病变细胞进行生理论研究

5、：通过培养正常或各种病变细胞进行生理，病理，药理等方面的研究理，病理，药理等方面的研究植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖培养基性质培养基性质固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基培养基特有成分培养基特有成分蔗糖蔗糖 植物激素植物激素葡萄糖葡萄糖 动物血清动物血清培养结果培养结果植物体植物体细胞株、细胞系细胞株、细胞系培养目的培养目的快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株无病毒植株获得细胞或细胞获得细胞或细胞分泌蛋白分泌蛋白 二二. .动物体细胞核移植和

6、克隆动物动物体细胞核移植和克隆动物（一）核移植：将动物的一个细胞的细胞核，移（一）核移植：将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，使这个新的胚胎组并发育成为一个新的胚胎，使这个新的胚胎最终发育成为动物个体。最终发育成为动物个体。（二）克隆动物：用核移植技术得到的动物。（二）克隆动物：用核移植技术得到的动物。 克隆：通过克隆：通过无性生殖而产生的具有完全相同的无性生殖而产生的具有完全相同的遗传组成的一群细胞或生物的个体，遗传组成的一群细胞或生物的个体，克隆在希克隆在希腊语中是腊语中是“小树枝叶小树枝叶”

7、的意思，用以指无性增的意思，用以指无性增殖动物，现在指个体，细胞，基因等不同水平殖动物，现在指个体，细胞，基因等不同水平上无性增殖动物。上无性增殖动物。卵细胞卵细胞母绵羊母绵羊母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移植细胞核移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂C母绵羊子宫母绵羊子宫胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠融合后的卵细胞融合后的卵细胞核移植技术：核移植技术：将动物的一将动物的一个细胞的细个细胞的细胞核，移入胞核，移入一个已经去一个已经去核的卵母细核的卵母细胞中，使其胞中，使其重新并发育重新并发育成为一个新成为一个新的胚胎，这的胚胎，这个新的胚胎个新的胚胎最终发育成

8、最终发育成为动物个体。为动物个体。分为：胚胎分为：胚胎细胞的核移细胞的核移植和体细胞植和体细胞核移植。核移植。1、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？2 2、用于核移植的供体细胞一般都选用传代、用于核移植的供体细胞一般都选用传代1010代以代以内的细胞，为什么？内的细胞，为什么？为使核移植动物的遗传物质全部来自为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值有利用价值的动物的动物提供的细胞。提供的细胞。1010代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，

9、未发生突变发生突变3 3、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？的复制吗？为什么？不是，克隆动物绝大部分不是，克隆动物绝大部分DNADNA来自供体细胞核，但来自供体细胞核，但核外还有少部分核外还有少部分DNADNA（如线粒体（如线粒体DNADNA）来自受体卵）来自受体卵母细胞母细胞（三）体细胞核移植技术的应用（三）体细胞核移植技术的应用阅读阅读P49-501、畜牧业方面：、畜牧业方面：2、医药卫生方面：、医药卫生方面：可以加速家畜遗传改良的进程，促进优良畜群繁育。可以加速家畜遗传改良的进程，促进优

10、良畜群繁育。 保护濒危物种，增加其存活数量保护濒危物种，增加其存活数量生产医用蛋白质生产医用蛋白质 组织器官的移植组织器官的移植3、其他领域、其他领域了解胚胎发育及衰老过程了解胚胎发育及衰老过程更好追踪研究疾病的发展过程、治疗疾病更好追踪研究疾病的发展过程、治疗疾病（四）体细胞核移植技术存在的问题（四）体细胞核移植技术存在的问题1、成功率低、成功率低2、克隆动物存在健康问题、克隆动物存在健康问题三三.动物细胞融合动物细胞融合 原理原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋

11、白质分子和脂质分子重凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。 灭活灭活：用物理或化学手段使病毒或细菌失去：用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染力，但是并不破坏这些病原体的抗原结感染力，但是并不破坏这些病原体的抗原结构。构。 概念概念：指两个或多个动物细胞结合成一个细胞的：指两个或多个动物细胞结合成一个细胞的过程。过程。 结果结果: :单核的杂交细胞。单核的杂交细胞。 原理原理：细胞膜的流动性。：细胞膜的流动性。 诱导的方法诱导的方法：物理法：离心，振动，电激：物理法：离心，振动，电激 化学法：化学法：PEGPEG 灭活的病毒灭活

12、的病毒注意：动物细胞融合需要把多个两种细胞放在一起，让他注意：动物细胞融合需要把多个两种细胞放在一起，让他们随机融合，而从中筛选杂交细胞。们随机融合，而从中筛选杂交细胞。意义：意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交( (种间，种间，属间，科间，甚至动植物间）成为可能。属间，科间，甚至动植物间）成为可能。四四. .单克隆抗体单克隆抗体1.传统抗体的获得方法：传统抗体的获得方法：长期以来，人们为了获得抗体，向动物体长期以来，人们为了获得抗体，向动物体反复反复注射注射某种抗某种抗原原，使动物产生抗体，从动物的，使动物产生抗体，从动物的血清血清中分离所需抗体，这

13、中分离所需抗体，这种方法种方法产量低，纯度低且特异性差产量低，纯度低且特异性差，反应不够灵敏。，反应不够灵敏。2.一个美丽的发现：一个美丽的发现：在动物发生免疫的过程中，体内的多种在动物发生免疫的过程中，体内的多种B淋巴可产生多达淋巴可产生多达百万种以上的抗体，但是百万种以上的抗体，但是每个每个B淋巴只分泌一种抗体淋巴只分泌一种抗体。要。要想获得大量的单一抗体，必须用单个的想获得大量的单一抗体，必须用单个的B淋巴进行无性生淋巴进行无性生殖，即克隆。殖，即克隆。B1B1B2B2B3B3B4B4B3B3B3B3 B3B3 3.3.一个大胆的猜想：一个大胆的猜想：将能够将能够产生特定抗体的产生特定抗

14、体的B淋巴细胞淋巴细胞与能在体外与能在体外大大量增殖的骨髓瘤细胞量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交进行融合，形成杂交瘤细胞。瘤细胞。 杰尼杰尼 丹麦丹麦 米尔斯坦米尔斯坦 英国英国 科勒科勒 德国德国注射抗原注射抗原B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合融合选择性培养基筛选选择性培养基筛选专一抗体检验阳性专一抗体检验阳性克隆化克隆化克隆化克隆化用有限稀释法进行用有限稀释法进行单克隆，再专一抗单克隆，再专一抗体检验阳性体检验阳性专一抗体检验阳性专一抗体检验阳性单克隆抗体单克隆抗体 细胞合成细胞合成DNADNA有有D D和和S S两条途径，其中两条途径，其中D D途径能被途径能被氨基喋呤

15、氨基喋呤阻断。人淋巴细胞有这两种途径，但阻断。人淋巴细胞有这两种途径，但一般不分裂增殖。骨髓瘤细胞中尽管没有一般不分裂增殖。骨髓瘤细胞中尽管没有S S途径，途径，但能不断分裂增殖。将这两种细胞在试管中混但能不断分裂增殖。将这两种细胞在试管中混合，加合，加PEGPEG促融，而后在培养液中加氨基喋呤。促融，而后在培养液中加氨基喋呤。B B淋巴细胞淋巴细胞D D途径途径S S途径途径骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞氨基喋呤氨基喋呤D D途径途径合成合成DNADNA 通过恰当的稀释达到分离单个细胞进行培养通过恰当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的。的目的。 （1 1）取出阳性孔的细胞数进行计数）取出阳性孔的细胞

16、数进行计数 （2 2）用培养液将其稀释到）用培养液将其稀释到10Cell10Cellmlml （3 3）如果在多孔板，每孔加）如果在多孔板，每孔加0.1ml0.1ml，其几率，其几率为每孔内落入一个细胞为每孔内落入一个细胞 （4 4）根据检测的阳性结果可进行克隆化）根据检测的阳性结果可进行克隆化 m mm m 4.单抗的制备过程： 1.1.抗原的制备抗原的制备 2.2.免疫动物免疫动物 3.3.免疫脾细胞和骨髓瘤细胞免疫脾细胞和骨髓瘤细胞 4.4.细胞融合细胞融合 5.5.杂交瘤细胞的选择培养杂交瘤细胞的选择培养 6.6.杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选 7.7.杂交瘤细胞的克隆化杂交瘤细胞的

17、克隆化 8.8.单克隆抗体的检定单克隆抗体的检定 9.9.分泌单克隆杂交瘤细胞系的建立分泌单克隆杂交瘤细胞系的建立 10.10.单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备5.单克隆抗体的概念： 由单个由单个B B淋巴细胞进行无性生殖形成的细胞群，淋巴细胞进行无性生殖形成的细胞群，产生的化学性质单一，特异性强的抗体。产生的化学性质单一，特异性强的抗体。6.6.优点：优点：特异性强，灵敏度高，并可大量制备。特异性强，灵敏度高，并可大量制备。五五. .单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用 1.1.作为诊断试剂作为诊断试剂准确，简易，高效，快速准确，简易，高效，快速 2.2.用于治疗疾病和运载药物用于治疗疾

18、病和运载药物用用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体制备成制备成“早早早孕诊断试剂早孕诊断试剂”。受精后不久，胎盘滋养层细胞会分泌受精后不久，胎盘滋养层细胞会分泌人绒毛膜促人绒毛膜促性腺激素（性腺激素（HCG)HCG)，是由受孕妇女体内胎盘产生的是由受孕妇女体内胎盘产生的一种糖蛋白类激素，在妇女的尿液中大量存在，一种糖蛋白类激素，在妇女的尿液中大量存在，而非妊娠妇女尿液中几乎没有。而非妊娠妇女尿液中几乎没有。早孕试纸利用早孕试纸利用抗人绒毛膜促性腺激素抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体单克隆抗体为配体，固定在层析住上，为配体，固定在层析住上，以以胶体金胶体金为指示标记，检测

19、尿液中为指示标记，检测尿液中HCGHCG浓度，来确定妇女是否怀孕。浓度，来确定妇女是否怀孕。阳性：出现两条红色条带，一条位于阳性：出现两条红色条带，一条位于对照区对照区C C，另一条位于检测区，另一条位于检测区T T，表明，表明已怀孕。已怀孕。阴性：仅在对照区阴性：仅在对照区C C出现一条红性条带，出现一条红性条带，在检测区在检测区T T无红色条带出现，表明未怀无红色条带出现，表明未怀孕。孕。无效：无效：5 5分钟内在对照区分钟内在对照区C C无红色条带无红色条带出现，则测试失效或试纸已失效。出现，则测试失效或试纸已失效。 甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFPAFP）是一种特异性较强的肿瘤标）是一种特异性较强的肿瘤标志物，用志物，用甲胎蛋白作为抗原免疫小鼠甲胎蛋白作为抗原免疫小鼠，制备制备抗抗AFPAFP单抗单抗，并与含有放射性同位素的标记物，并与含有放射性同位素的标记物连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过全连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过全身血液循环运送到所有组织，由于身血液循环运送到所有组织，由于肿瘤细胞肿瘤细胞表面的表面的AFPAFP会和单克隆抗体特异性结合会和单克隆抗体特异性结合，所以，所以放射性同位素标记物就不断积累在肿瘤上，放射性同位素标记物就不断积累在肿瘤上，通过一定的