原核表达之引物设计

1、原核表达 之之 引物设计自从1985年KarnyMullis发明了聚合酶链式反应(PCR)以来,PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一,而引物设计是PCR技术中至关重要的一环引物设计原则1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计 2.引物长度一般在1530碱基之间3.引物GC含量在40%60%之间，Tm值最好接近72 Tm= 4（G+C）+2（A+T） 4.引物3端要避开密码子的第3位 5.引物3端不能选择A，最好选择T 6. 碱基要随机分布 引物设计原则7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列 8. 引物5 端和中间G值应该相对较高，而3 端G值较低 9.引物的5端可以修饰

2、，而3端不可修饰 10. 扩增产物的单链不能形成二级结构 11. 引物应具有特异性 常用引物设计软件 Premier Primer 5.0 Oligo 6.0 Vector NTI Suit Dnasis Omiga DnastarPremier Primer 5.0主要功能:1.自动搜索2.引物设计3.限制性内切酶位点分析4.DNA 基元(motif)查找5.同源性分析Oligo 6.01.功能较Premier Primer 5.0更为单一，主要是引物设计及引物评价2.常与Premier Primer 5.0联合使用进行原核表达所用引物的设计原核表达引物设计实例分析鸭疫里氏杆菌（Riemer

3、ella anatipestifer）ompA 登录NCBI：/共，按照把各位数字相加，除以得整数，即可认为这一序列能编码完整的氨基酸序列鸭疫里氏杆菌 ompA序列ATGGACAAGGAGTTTATGTTGATGACTGGTCTTGGTCTTCAGCTTAAATTTGCTGGTCTTCTTTTTGGAAATGGACAAGGAGTTTATGTTGATGACTGGTCTTGGTCTTCAGCTTAAATTTGCTGGTCTTCTTTTTGGAAACGAAGATGCGTGGTTTGACCCTTATGTAAGAGTTGGAGCCAACTATTTGAG

4、ACACGACTATACAGGTCTACGAAGATGCGTGGTTTGACCCTTATGTAAGAGTTGGAGCCAACTATTTGAGACACGACTATACAGGTCTTACGTTCCCTGTGACTGATAGCTACAATGATGTAACTTACGCGGGGTATAGCGAAAATAAACCATACACTTACGTTCCCTGTGACTGATAGCTACAATGATGTAACTTACGCGGGGTATAGCGAAAATAAACCATACACTCAAGGAAGAGCGGATCATTTTGCTTTATCAACAGGTTTAGGTACAAACATTTGGTTAACTAAGAACTTTGCA

5、AGGAAGAGCGGATCATTTTGCTTTATCAACAGGTTTAGGTACAAACATTTGGTTAACTAAGAACTTTGGTCTTGGTATCCAAGGGGATTATGTTTCTACTCCAGTAGATAAGTCTGGATTGGCTAACTTTTGGCAAGCGTCTTGGTATCCAAGGGGATTATGTTTCTACTCCAGTAGATAAGTCTGGATTGGCTAACTTTTGGCAAGCGTCAGCTTCATTGAACTTTAGATTTGGTAACAGAGATAAGGATAAGGATGGAGTGTTAGATAAAGACGATGTCAGCTTCATTGAACTTTAGA

6、TTTGGTAACAGAGATAAGGATAAGGATGGAGTGTTAGATAAAGACGATTTATGTCCAGAAATACCAGGTTTACCTGAATTCCAAGGTTGTCCAGATACAGATGGCGATGGAGTTCCAGTTATGTCCAGAAATACCAGGTTTACCTGAATTCCAAGGTTGTCCAGATACAGATGGCGATGGAGTTCCAGATAAAGATGATAACTGTCCAGAAGTTGCAGGACCAGTTGAAAACAACGGTTGTCCTTGGCCAGATACAGAATAAAGATGATAACTGTCCAGAAGTTGCAGGACCAGTTGAAA

7、ACAACGGTTGTCCTTGGCCAGATACAGACAAAGATGGTGTATTGGATAAAGACGATGCTTGTGTTGATGTAGCTGGACCTGCTGAAAACAATGGTTGTCAAAGATGGTGTATTGGATAAAGACGATGCTTGTGTTGATGTAGCTGGACCTGCTGAAAACAATGGTTGTCCTTGGCCAGATACAGATAATGATGGAGTATTAGATAAAGATGATAAGTGTCCTAATGTTCCAGGTCTTCCCTTGGCCAGATACAGATAATGATGGAGTATTAGATAAAGATGATAAGTGTCCTAATGTTCC

8、AGGTCTTCCAGAATACAAAGGTTGTCCTAAGCCTCAGGAAGCGTATGCAGTTGAAGCAACAGGAGCATTAAAGGGTATCAGAATACAAAGGTTGTCCTAAGCCTCAGGAAGCGTATGCAGTTGAAGCAACAGGAGCATTAAAGGGTATATTCTTCAACTTTAATAAAGCATCTATCAGACCTGAATCTAATACTAAGTTAGATCAAGCTGCTGAAGTGATTCTTCAACTTTAATAAAGCATCTATCAGACCTGAATCTAATACTAAGTTAGATCAAGCTGCTGAAGTGATTAAGTCTTCT

9、AACGGAGGTACTTTCTTAGTGGTAGGTCATACGGATGTTAAGGGTAATGCTAACTACAATTAAGTCTTCTAACGGAGGTACTTTCTTAGTGGTAGGTCATACGGATGTTAAGGGTAATGCTAACTACAACTTGAAACTTTCTAGAGAAAGAGCTGCATCTGTAGTAGCTGCTTTAGAAGCTAGAGGAGTTAATCCATCACTTGAAACTTTCTAGAGAAAGAGCTGCATCTGTAGTAGCTGCTTTAGAAGCTAGAGGAGTTAATCCATCTCAGTTAAAATCTAAAGGGGTTGGTTCTGCTG

10、AAGCTACAGTACCAGCGTCTGCTTCTAACGAAGAGAGATCAGTTAAAATCTAAAGGGGTTGGTTCTGCTGAAGCTACAGTACCAGCGTCTGCTTCTAACGAAGAGAGAATGAAAGACAGAAAAGTGGTTGTAGAAGCAATCAGCGGATCTGCTTGGGAAGCTCTTCAAAAGTCTGATCATGAAAGACAGAAAAGTGGTTGTAGAAGCAATCAGCGGATCTGCTTGGGAAGCTCTTCAAAAGTCTGATCTTCCAGTAGTGAAGAAAAAAGTAGTAAAAAAGAAAAGAAAATAA TTCCAGT

11、AGTGAAGAAAAAAGTAGTAAAAAAGAAAAGAAAATAA 将基因序列复制粘贴到EditSeq软件内并保存将DNA Sequence 翻译成氨基酸序列Control+A 选中DNA Sequence,点击“Goodies” “Translate DNA”查看有无信号肽（Signal Peptide）SignalP 3.0 Server :http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/打开Oligo 6.0点击 “”“Current oligo length”点击“”“”点击“”“”“”下拉滚动条，下一方块中的数值要求同上同样的操作查同样的操作查看看”False False Priming Sites”Pr