荧光定量PCR技术原理与应用

1、荧光定量荧光定量PCRPCR技术原理与应用技术原理与应用Outline 应用应用 基本原理基本原理 方法方法 定量定量PCRPCR实验设计实验设计 数据处理数据处理核酸的定量（核酸的定量（RNARNA、DNADNA的定量）的定量） 核酸定性分析如核酸定性分析如SNPSNP分析分析基因型分析基因型分析RNARNA变异分析变异分析溶解曲线分析溶解曲线分析 （HRMHRM）各种核酸染料Taqman探针分子信标复合探针等如：用如：用SYBR Green ISYBR Green I进行进行GMOGMO定量定量l转基因生物又称遗传修饰生物(Genetically Modified Organisms，GM

2、O)，经基因工程技术改变基因组构成的生物，包括转基因植物、转基因微生物和转基因动物。 l目前为止，包括欧盟国家在内的40余个国家 标识管理l食物种转基因成分规定：欧盟出台转基因产品的标识制度(1990) ，规定0.9%阈值标准（2003) 转基因大豆 抗杀草剂 草甘膦 转基因大米 BT蛋白 转基因棉花 苏云金杆菌基因 抗虫 转基因番茄 抗冻蛋白 抗冻通过内标基因（转基因与非转基因植物都等量表达）来对每个样品DNA进行定量定量外源基因（只有转基因植物表达）的比例来进行GMO含量检测核酸变异核酸变异 TaqmanTaqman探针分析法探针分析法 复合探针法复合探针法 高分辨率熔解高分辨率熔解(Hi

3、gh-resolution melting，简称HRM)分析法 应用在、等如：如：SNPSNP分析分析 SNPSNP（单核苷酸多态性）（单核苷酸多态性）人类基因组中的单碱基突变人类基因组中的单碱基突变大约大约93%93%的基因至少含有一个的基因至少含有一个SNPSNP SNPSNP分型的意义分型的意义可能引起疾病或疾病的易感性可能引起疾病或疾病的易感性作为基因缺陷型疾病的标志物作为基因缺陷型疾病的标志物SNPSNP的漂变可作为进化研究手段的漂变可作为进化研究手段药物的抗药性研究药物的抗药性研究方法：方法： HRM HRM分析分析如：甲基化如：甲基化 HRMHRM分析分析 DNA甲基化是最早发现

4、的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5-端的胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。阅微基因通过以下方法提供甲基化检测服务：医疗方面医疗方面 临床检测 疾病的临床早期诊断 疗效的考评 遗传病的诊断 等位基因的检测 多基因遗

5、传病的突变检测 基因表达异常所导致的疾病的检测 肿瘤的诊断 肿瘤相关基因的表达检测 肿瘤标志物检测研究方面研究方面 药物及医疗相关 新药研发 药物疗效研究 分子生物学方面 研究各种处理对细胞中基因表达变化的影响 比较染病组织与正常组织中各种mRNA含量差异 DNA或RNA的转染量与实验结果关系的研究 基因整合拷贝数的研究研究方面研究方面 植物学方面： 转基因植物中基因拷贝数与性状的关系 监测转基因植物中基因拷贝数的变化 转基因植株早期的筛选 监测农作物病虫害抗药性变化 研究新的药物及方法 动物学方面： 动物疫情监测 新的防止疫情发生及控制的药物及方法的研究 转基因动物中目的基因拷贝数与品质的关

6、系研究及早期筛选1 实时定量实时定量PCR技术：技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析终点产物 定量和定性分析无法对起始模板准确定量无法对扩增反应实时检测3 常用名词概念常用名词概念l 扩增曲线扩增曲线l 荧光阈值荧光阈值l Ct值值l 溶解曲线溶解曲线l定量定量PCR仪仪l电脑电脑l分析软件分析软件l试剂及耗材试剂及耗材 2 系统组成系统组成荧光基团荧光检测元件扩增曲线扩增曲线Cycle（循环（循环数）数）Rn（荧光强度）（荧光强度）BaselineLgliner phase1 前15个循环信号作为荧光本

7、底信号（baseline）1 荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍1 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段1 真正的信号:荧光信号超过阈值Threshold荧光阈值荧光阈值平台期平台期Ct值的定义：值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）Ct value CtCt值值横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵轴：荧光信号量纵轴：荧光信号量相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性Ct值特性值特性 1 重现性重现性Cycle

8、 numberCk 104Ck 102SampleLg of DNA concentration0 模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。0 Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。Ct值特性值特性 2 与模板量的对应性与模板量的对应性SYBGreen法溶解曲线法溶解曲线特异性特异性线性关系、扩增效率确认线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认检测灵敏度确认No template controlNo template control确认确认标准曲线斜率标准曲线斜率: -3 : -3 -3.5-3.535 Cycles35 Cycles内可得到好的定量结果内可得到好的定量结果如果采

9、用如果采用SYBRSYBR检测方法，检测方法，30 30 CyclesCycles内无非特异性产物扩增内无非特异性产物扩增35 Cycles35 Cycles内无引物二聚体产生内无引物二聚体产生相关系数（相关系数（R R2 2）：大于）：大于0.980.98荧光定量荧光定量PCR反应性的确认反应性的确认PCRPCR扩增效率（扩增效率（E E）:0.9-1.2:0.9-1.21 1 非特异性荧光标记：非特异性荧光标记： SYBR Green 2 2 特异性荧光标记：特异性荧光标记： TaqMan法 分子信标法Molecular Beacon 复合探针法Amplisensor 高分辨率熔解(Hig

10、h-resolution melting，简称HRM)Molecular Beacon、Amplisensor技术是基于探针技术发展起来的，原理与TaqMan法相似1 SYBR Green1 SYBR Green法法SYBR Green 染料能结合到双链DNA的小沟部位，形成双链DNA后发出荧光。变性时，DNA双链分开，无荧光。SYBR Green 对DNA模板没有选择性适用于任何DNA，使用方便不必 设计复杂探针, 非常灵敏，灵敏， 价格低廉价格低廉容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性假阳性，对引物特异性要求较高融解曲线融解曲线融解温度TM非特异扩增产物目的基因产物2 2 TaqManT

11、aqMan法法-水解型杂交探针水解型杂交探针探针结构探针结构利用Taq酶有 3 5外切核酸酶活性，可水解探针l优点：优点：l缺点缺点探针探针Tm为为68-70 ；引物；引物Tm为为59-60 基因型分析基因型分析(G/G)(G/G)（正常）（正常）(G/A)(G/A)（正常）（正常）(A/A)(A/A)（异常）（异常）FRFQCVQTAFQCVQTForward primerReverse primerAllele-specific probeAllele-specific probeFRG双色荧光实验结果实验结果VICFAMFAMVICVICFAM(A/A)(G/A)(G/G)FQCVQT+

12、 标记荧光的发夹探针 + 环与目标序列互补+ 茎由互补配对序列组成环荧光素 淬灭剂茎3 3 分子信标分子信标水解型探针水解型探针FRET工作原理工作原理+高特异性：对目标序列+ 检测SNP最灵敏的试剂之一+荧光背景低优 点+ 只能用于一个特定目标+ 设计困难+ 稳定性差杂交时探针不能肯定完全与模板结合+ 价格比较高缺 点分子信标优缺点分子信标优缺点4 4 饱和染料饱和染料 HRM(HRM(高分辨率溶解曲线分析技术高分辨率溶解曲线分析技术) )饱和染料饱和染料 不饱和染料不饱和染料 原理：原理：每一段DNA都有其独特的序列，也就有了独特的熔解曲线形状，应用饱和荧光染料和高分辨率的熔解曲线分析技术

13、可精确对样品的基因型进行分析，精度可达单碱基差异。溶解曲线溶解曲线1 突变扫描突变扫描和基因分型基因分型的遗传分析方法2 在PCR结束后结束后直接运行高分辨熔解3 需要特殊荧光定量PCR仪仪缺点：缺点：仪器受限 饱和染料种类：饱和染料种类： EvaGreen、LCGreen、SYBR GreenER和SYTO 9 染料 HRM分析仪器：分析仪器： 美国Idaho公司：LightScanner96 美国：Rapid Cycler； Bio-Rad：Precision melt supermix（EvaGreen染料）优点：优点：高通量、简单、快速、高灵敏度、成本低廉 避免污染造成的假阳性； 可检

14、测已知和未知SNP； 400bp扩增产物内SNP，灵敏度和精确度100%。 几种方法的比较方法优点缺点适用范围SYBR Green I 方法适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMan 方法特异性高重复性好价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核遗传疾病的诊断Molecular Beacon法(分子信标)高特异性荧光背景低只适合特定目标设计困难价格高特定基因分析SNP分析 1 目标样品准备 2 目的生物靶基因生物信息分析引物 3 选什么荧光素 4 针对性定量试剂盒 5 PCR误差控制

15、6 预期用哪种分析方法 7 定量PCR板的设置 8 PCR组分体系及上机目的基因看家基因1 目标样品准备目标样品准备 mRNA （mRNA或cDNA） cDNA DNA 质粒DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 -2.0之间DNA用量：0.05 ng 100 ngRNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL 外界刺激外界刺激 1010分钟分钟 可检测的表达改变可检测的表达改变 样品离开定义环境样品离开定义环境 2 2分钟内分钟内 固定、裂解细胞固定、裂解细胞 RNARNA样本保存液样本保存液 Trizol Triz

16、ol 超纯超纯RNARNA提取试剂盒提取试剂盒 RNARNA的评价与鉴定的评价与鉴定 - - 完整性完整性 - - 纯度纯度 小心小心DNADNA污染！污染！ - - 使用使用DNaseDNase - - 引物设计引物设计 - - 以以RNARNA作作PCRPCR阴性对照阴性对照mRNA mRNA 逆转录的选择逆转录的选择 逆转录引物选择逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNAAbundant RNA的干扰：的干扰：mRNA or total RNAmRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？检测灵敏度是否足够？ 逆转录酶

17、逆转录酶 SuperRT SuperRT 逆转录酶（逆转录酶（RNase HRNase H- -） HiFi-MMLVHiFi-MMLV逆转录酶（逆转录酶（RNase HRNase H- -）引物引物特异性特异性反应效率反应效率Oligo dTOligo dT中中低低Random hexmerRandom hexmer低低中中Specific primerSpecific primer高高高高总原则与普通总原则与普通PCRPCR相同：相同：l避免引物二聚体，避免二级结构避免引物二聚体，避免二级结构l扩增片段长度（扩增片段长度（80 80 300 bp) 300 bp)l推荐做跨推荐做跨intr

18、onintron设计设计EXON 1EXON 2INTRON 2DNAEXON 1EXON 2RNA2 引物引物 生物信息分析 NCBI荧光定量PCRPCR引物设计引物设计Taqman探针设计原则常用引物设计软件引物分析溶解曲线，特异性融解曲线分析- 单一特异性产物 将温度对荧光强度的变化求导3 选什么荧光素选什么荧光素 SYBR Green Taqman 饱和荧光素 和试验目的相关和试验目的相关表达差异分析SNP分析甲基化分析4 针对性荧光定量试剂盒针对性荧光定量试剂盒 ABI Takara Bio-rad LightScanner5 PCR误差控制误差控制防止人为污染防止人为污染使用使用M

19、aster mixMaster mix配置预混体系配置预混体系设置生物学重复（不同个体设置生物学重复（不同个体-3-8-3-8个）个）技术性重复技术性重复 （复孔（复孔-3-3次）次）阳性及阴性对照阳性及阴性对照6 预期用哪种分析方法预期用哪种分析方法 单标准曲线法 双标准曲线法 2 -Ct法法预期用哪种分析方法直接涉及到预期用哪种分析方法直接涉及到PCR板上的孔设置板上的孔设置标准曲线样品标准曲线样品标准品标准品标准品梯度稀释方法标准品梯度稀释方法- - 融解曲线：融解曲线：单一特异性产物单一特异性产物- - 扩增曲线：扩增曲线：CtCt值值- - 标准曲线：标准曲线：扩增效率尽量高，目的基

20、因扩增效率尽量高，目的基因尽可能接近内参基因尽可能接近内参基因从标准曲线入手，分析内参基因从标准曲线入手，分析内参基因 目的基因扩增效果目的基因扩增效果 96孔板设置举例7 定量定量PCR板的设置板的设置单标法单标法1、引物、探针的设计：、引物、探针的设计： 探针Tm为55-60 ，30 bp, 3不能有T， 扩增片段90400 bp2、反应参数的确定：、反应参数的确定： 一般为：94 ，10-20S 55-60，30S 72 ，30S 采集荧光 55-94 ，每5S降低0.5 ，采集荧光，形成溶解曲线 3、其他与常规、其他与常规PCR相同相同（1）SYBR GreenPCR体系的建立体系的建

21、立8 PCR组分体系及上机组分体系及上机1、引物、探针的设计：、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定：、反应参数的确定： 一般为：94 ，10-20S 60，30-60S （Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高），也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度：获得最小、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号值，最大信号/背景比值背景比值 引物浓度：100-900nM 探针浓度：50-300nM4、其他与常规、其他与常规PCR相同相同（2）Taq

22、man探针法探针法PCR体系的建立体系的建立 1. 标准曲线法的绝对定量 2. 标准曲线法的相对定量 3. 比较CT法的相对定量 PCR曲线标准曲线Sample25绝对定量的定义绝对定量的定义0 Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系0 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 绝对定量解析方法绝对定量解析方法单标法 一个目的基因 即需要确定其量值的核酸序列。 一组标准样本 用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。 重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。

23、标记方法的选择SYBR Green法或探针法均可。 实验结果显示扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。绝对定量分析几要素绝对定量分析几要素质粒标准品的制备质粒标准品的制备PCRPCR目的基因克隆目的基因克隆质粒质粒基因组基因组DNADNA拷贝数的计算：拷贝数的计算：待测样本浓度（ng/ul）OD26040稀释倍数样本分子量=碱基数324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014 倍比梯度稀释方法：倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品i

24、v1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v质粒标准品稀释方法与拷贝数计算质粒标准品稀释方法与拷贝数计算q 方方 法：法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测q 试试 剂：剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203）q 标准品：标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103 ；2个重复；设阴性空白对照q 实验步骤：实验步骤：提取HBV DNA； 设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。绝对定量实验例绝对定量实验例乙肝病人血液

25、中乙肝病人血液中HBVHBV的绝对定量的绝对定量SampleSamplecopies/mcopies/ml lCt1Ct1Ct2Ct2Mean CtMean CtSTDSTD标准品510328.1828.6428.410.16标准品510425.2525.1425.190.04标准品510522.1122.4622.280.12标准品510618.6318.9218.770.10未知样品? ?20.5620.4520.50.05空白对照NoneNone实验数据实验数据绝对定量实验例绝对定量实验例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV的绝对定量的绝对定量扩增效率（扩增效率（E）计算）计算 E

26、= 10-1/斜率 1 = 10-1/-3.29 1 = 2.011 = 1.01 标准曲线制作：标准曲线制作：利用利用Mean Ct 作图可得到标准曲线作图可得到标准曲线y = -3.29x + 40.33 R2 = 0.9978绝对定量实验例绝对定量实验例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV的绝对定量的绝对定量未知样品拷贝数的计算未知样品拷贝数的计算将Ct值带入线性方程：20.5= -3.29 X + 40.33QuantityUnknown=10 6.03 =1,071,519 copies 绝对定量实验例绝对定量实验例乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV的绝对定量的绝对定量X=

27、20.5-40.33-3.29=6.03 相对定量解析方法相对定量解析方法相对定量分析方法相对定量分析方法比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！关注点：关注点：基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！ 一个参照样本 一个或一个以上的未知样本 一个目的基因 管家基因用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量 重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。 标记方法的选择SYBR Green法或探针法均可。 实验结果显示扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要）。 一

28、组标准样本（有些分析方法不需要）相对定量分析几要素相对定量分析几要素P P P P P P O O 双标准曲线法双标准曲线法 2 -Ct法法 通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。表达量。 相对值相对值= =校正值校正值= =目的基因定量结果目的基因定量结果管家基因定量结果管家基因定量结果待测样品的校正值待测样品的校正值对照样品的校正值对照样品的校正值公式：公式： 图图2 2EffciencyEffciencyslopeslope内参

29、基因内参基因100%100%-3.32-3.32目的基因目的基因Primer 2Primer 278%78%-4.00-4.00 图图1 1EffciencyEffciencyslopeslope内参基因内参基因100%100%-3.32-3.32目的基因目的基因Primer 1Primer 195.36%95.36%-3.43-3.43双标准曲线分析- 扩增效率尽量高- 目的基因尽可能接近内参基因10%以内优点：分析简单，实验优化相对简单优点：分析简单，实验优化相对简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线应用：基因表达调控研究中最常用与

30、公认的两种相对定量方法之一应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一检测样品检测样品管家基因管家基因H H目的基因目的基因X X定量结果定量结果定量结定量结果果校正值校正值相对量相对量对照样品对照样品6391.56391.5343.4343.40.0530.0537 71.0001.000待测样品待测样品1 18589.78589.717.317.30.0020.0020 00.0370.037待测样品待测样品2 27432.97432.91946.11946.10.2610.2618 84.8744.874实验数据实验数据2 2 法法CtCtX T 是目标分子达到设定的阈值时

31、的分子数是目标分子达到设定的阈值时的分子数RT是内参分子达到设定的阈值时的分子数是内参分子达到设定的阈值时的分子数 假设目标序列与内参序列扩增效率相同假设目标序列与内参序列扩增效率相同： 或或最后用任一样本最后用任一样本 q 的的 X N 除以参照因子（除以参照因子（ calibrator ， cb ）的）的 X N 得得到：到： 对于一个少于对于一个少于 150bp 的扩增片断而言，如果的扩增片断而言，如果 Mg 2+ 浓度、引物都进行了适当的优化，浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于扩增效率接近于 1 。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言。因此目标序列的量通过内

32、均一化处理之后相对于参照因子而言就是：就是： 公式：公式：F = 22 2 法法优点：无需作标准曲线优点：无需作标准曲线缺点：假定扩增效率为缺点：假定扩增效率为 100 %； 假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致； 实验条件优化较为复杂。实验条件优化较为复杂。应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 待测组目的基因平均Ct值待测组内参基因平均Ct值对照组目的基因平均Ct值对照组内参基因平均Ct值CtCt实验数据：实验数据：Sample 处理前 处理后 Jun(Mea

33、nCt) GAPDH(MeanCt)E18161717.41.951.952 - Ct法：法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%Ct（处理前）18171 Ct（处理后）1617.4=1.4Ct=Ct（处理后）Ct（处理前）1.412.4比率（处理后/处理前）=2Ct2（2.4） = 5.3 所以所以JunJun基因在处理后表达水平是处理前的基因在处理后表达水平是处理前的5.35.3倍倍修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于2，那么那么2Ct

34、可以修正为：可以修正为：ECt，例如扩增效率为，例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为，那么计算公式可修正为1.95Ct2 -2 -CtCt法法SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项样品制备样品制备定量体系配备定量体系配备引物设计引物设计反应条件优化反应条件优化浓度确定浓度确定技能要求技能要求环境要求环境要求误差控制误差控制数据分析数据分析仪器介绍仪器介绍RT上机上机反应体系优化反应体系优化试剂选择试剂选择分析方法分析方法样品制备样品制备环境要求环境要求定量体系配备定量体系配备数据分析数据分析RT上机上机浓度确定浓度确定SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项无RNas

35、e环境使用无RNase耗材专用RNase-free工具分光光度计检测电泳检测RT反应体系优化反应体系优化试剂选择试剂选择样品制备样品制备定量体系配备定量体系配备数据分析数据分析上机上机AMVM-MLVQuant下游反应数确定反转录体积引物的选择SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项定量体系配备定量体系配备引物设计引物设计浓度确定浓度确定环境要求环境要求误差控制误差控制RT样品制备样品制备数据分析数据分析上机上机核酸制备区反应液制备区制作标准曲线设定浓度区间使用mix降低系统误差设置重复（3次）设置空白和阴性对照GC：5060Tm：5065单个碱基重复4个无二级结构扩增长度：10020

36、0bp反应体系优化反应体系优化上机上机反应条件优化反应条件优化RT样品制备样品制备模板准备模板准备数据分析数据分析退火温度优化：梯度PCR延伸时间：产物长度决定反应体积5ul，推荐2050ul引物浓度优化，模板量优化Mg2调节，酶活调节扩增效率：90110重复性：std0.2标准曲线：R0.99或R2 0.98SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项标准品待测样本阳性对照阴性对照技能要求技能要求误差控制误差控制仪器介绍仪器介绍上机上机试剂选择试剂选择RT样品制备样品制备模板准备模板准备数据分析数据分析自配realmastermixRCHO-Lightcycler seriesROTOGEN-RG seriesBIO-RA