动物组织细胞培养

1、12 目录动物细胞体外培养环境动物细胞体外培养环境动物细胞体外培养方法动物细胞体外培养方法动物细胞体外培养的生物学特性动物细胞体外培养的生物学特性培养细胞常规检查和特性鉴定培养细胞常规检查和特性鉴定细胞同步化细胞同步化细胞冷冻与复苏细胞冷冻与复苏器官培养器官培养3 防止污染、无菌操作是动物组织培养成功的关键！4 1 1培养前准备：制定实验方案和操作程序。培养前准备：制定实验方案和操作程序。 2 2超净台要用超净台要用75%75%酒精擦洗，然后紫外线消毒酒精擦洗，然后紫外线消毒3030分钟，工作台面上用品不要过多或重叠放置。分钟，工作台面上用品不要过多或重叠放置。 3 3个人进入无菌培养室原那么

2、上须彻底洗手并按个人进入无菌培养室原那么上须彻底洗手并按外科手术要求着装，开始操作前要用外科手术要求着装，开始操作前要用75%75%酒精或酒精或0.2%0.2%新洁而灭消毒手和前臂。新洁而灭消毒手和前臂。 4 4实验中需保持无菌操作要求。实验前要点燃酒实验中需保持无菌操作要求。实验前要点燃酒精灯，烧过的器械要注意冷却，以防细胞损伤。精灯，烧过的器械要注意冷却，以防细胞损伤。 5 5分别使用不同吸管吸取营养液、分别使用不同吸管吸取营养液、PBSPBS、细胞悬、细胞悬液及其它各种用液，而不能混用液及其它各种用液，而不能混用 6 6不要用手触及已消毒的器皿，如已接触，要用不要用手触及已消毒的器皿，如

3、已接触，要用火焰灼烧或取备用品更换。火焰灼烧或取备用品更换。 7 7注意操作时勿大声讲话或咳嗽。注意操作时勿大声讲话或咳嗽。5根本概念 分类：分类： 器官培养器官培养 组织培养组织培养 细胞培养细胞培养 定义：定义： 动物细胞培养动物细胞培养是指将动物的某一组织如肝脏、是指将动物的某一组织如肝脏、肺、肾脏等组织取出，使其分散成单个细胞，肺、肾脏等组织取出，使其分散成单个细胞，在人工条件下在人工条件下(无菌、适当温度和一定营养条无菌、适当温度和一定营养条件件下下) )，使之存活、生长和增殖的技术，使之存活、生长和增殖的技术 。6根本概念 定义：定义： 动物组织培养动物组织培养(tissue cu

4、lture)是指从是指从动物体内取出组织并模拟体内生理环境，动物体内取出组织并模拟体内生理环境，使之在体外人工条件下生存和生长，并使之在体外人工条件下生存和生长，并维持其结构和功能不变的技术。维持其结构和功能不变的技术。 器官培养器官培养(organ culture)的培养对象的培养对象是整个器官、器官的一局部，是在模拟是整个器官、器官的一局部，是在模拟体内的生理环境，使之在体外存活、生体内的生理环境，使之在体外存活、生长和保持一定功能的技术。长和保持一定功能的技术。 7根本概念8动物细胞体外培养环境动物细胞体外培养环境4.1.1 4.1.1 温度温度4.1.2 pH4.1.2 pH4.1.3

5、 4.1.3 渗透压渗透压4.1.4 4.1.4 气相气相4.1.5 4.1.5 生长基质生长基质94.1.1 温度 无论来源于何种有机体的细胞培养都需要一个与体内生存环境尽可能一致的生长条件，其中最根本的条件之一是恒定的适宜的温度环境 。 人和大多数哺乳动物培养细胞的最适温度在37左右。培养细胞对低温的耐受力比对高温强。 104.1.1 4.1.1 温度温度细胞培养在细胞培养在3940中中1 h，即会受到一定损，即会受到一定损伤，但仍能恢复。当在伤，但仍能恢复。当在4142的温度条件的温度条件下培养下培养1 h，细胞那么会受到严重损伤，但不，细胞那么会受到严重损伤，但不致于全部死亡，局部仍可

6、能恢复。当温度达致于全部死亡，局部仍可能恢复。当温度达43以上时，细胞大多死亡。以上时，细胞大多死亡。温度低于正常范围的环境，总的来说，只要温度低于正常范围的环境，总的来说，只要温度不低于温度不低于0时，低温只能抑制细胞代谢，时，低温只能抑制细胞代谢，并无伤害作用。并无伤害作用。 114.1.2 pH细胞内、外细胞内、外pHpH调节是哺乳动物细胞和机体生调节是哺乳动物细胞和机体生存的根本条件。存的根本条件。pHpH不仅对维持离子平衡，而不仅对维持离子平衡，而且对保持细胞的最正确酶功能状态和激素及且对保持细胞的最正确酶功能状态和激素及生长因子对细胞外表受体的亲和力都很重要。生长因子对细胞外表受体

7、的亲和力都很重要。124.1.2 pH大多数培养液设计的大多数培养液设计的pH为为7.4，最适宜是，最适宜是，不同的细胞类型可能有一个小的最适不同的细胞类型可能有一个小的最适pH变化变化范围，细胞能够耐受范围，细胞能够耐受pH在这个范围内的偏离，在这个范围内的偏离，大多数细胞能耐受的培养液大多数细胞能耐受的培养液pH范围为范围为6.87.6，超出这一范围会致死细胞。，超出这一范围会致死细胞。134.1.3 4.1.3 渗透压渗透压渗透压；渗透压；260260320320mOsm/kgmOsm/kg适用于大多数细胞适用于大多数细胞。144.1.4 4.1.4 气相气相O2(oxygen)参与细胞

8、的能量代谢，为细胞生参与细胞的能量代谢，为细胞生命活动提供能量；命活动提供能量； CO2(carbondioxide)主要主要与维持培养液的酸碱度有直接关系与维持培养液的酸碱度有直接关系 。大多数体外培养的气相环境为含大多数体外培养的气相环境为含5的的CO2和和95空气的混合气体，其中氧浓度为空气的混合气体，其中氧浓度为2121.3 kPa(160mmHg)。必要时，可通人。必要时，可通人N2以稀释以稀释O2，调节培养箱内，调节培养箱内O2的浓度。的浓度。 154.1.5 4.1.5 生长基质生长基质 在体内条件下，大局部细胞贴附于结缔组织、基膜或矿物基质(如骨组织)。仅有血液、淋巴和其他液体

9、内的细胞能够在悬浮状态下生长。 多聚赖氨酸 纤维连接蛋白 层粘连蛋白 胶原 亲玻粘连蛋白 韧粘素 人工膜 饲养层16动物细胞体外培养方法动物细胞体外培养方法原代培养与传代培养原代培养与传代培养动物细胞培养的方法动物细胞培养的方法动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术17原代培养与传代培养原代培养与传代培养大多数体外培养的动物细胞都需要贴附于适大多数体外培养的动物细胞都需要贴附于适当的基质上才能生长，细胞的这种特性叫做当的基质上才能生长，细胞的这种特性叫做贴壁依赖性贴壁依赖性(anchorage-dependent)。依据。依据细胞的生长是否需要贴壁，动物细胞体外培细胞的生长是否需要贴壁，

10、动物细胞体外培养又可分为两类：养又可分为两类：贴壁培养贴壁培养(adherent culture)和和悬浮培养悬浮培养(suspension culture)。18原代培养与传代培养原代培养与传代培养 在动物细胞体外培养中，按照培养过程中培在动物细胞体外培养中，按照培养过程中培养物是否需要被分割后再培养，而将体外培养物是否需要被分割后再培养，而将体外培养分为养分为原代培养原代培养或称或称初代培养初代培养(primary culture)和和传代培养传代培养(subculture)，传代培养，传代培养又称又称继代培养继代培养(secondary culture)。19原代培养与传代培养原代培养与

11、传代培养原代培养是从机体取得材料开始，将培养物原代培养是从机体取得材料开始，将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物，直到第一次传代前的这一培养过割培养物，直到第一次传代前的这一培养过程。程。原代培养的培养物的结构形式分为两种，一原代培养的培养物的结构形式分为两种，一种是利用小块组织或称为组织块种是利用小块组织或称为组织块(tissue block)进行培养，另一种是将机体组织分散进行培养，另一种是将机体组织分散后制成单细胞进行培养酶消化法。后制成单细胞进行培养酶消化法。 20原代培养原代培养组织块原代培养组织块原代培养21原代培养组织块原代

12、培养组织块原代培养22原代培养组织块原代培养组织块原代培养23原代培养原代培养离散细胞离散细胞原代培养原代培养 在组织消化中，常用的消化酶包括胰蛋白酶、在组织消化中，常用的消化酶包括胰蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶、裂解酶及链霉蛋白酶的粗制品等。这些酶既可酶、裂解酶及链霉蛋白酶的粗制品等。这些酶既可单独使用，又可多种联合使用。因为粗制品常混杂单独使用，又可多种联合使用。因为粗制品常混杂有其他蛋白酶，所以粗制品通常比精制品更有效，有其他蛋白酶，所以粗制品通常比精制品更有效，而精制品更具有特异性，并且毒性小。胰蛋白酶和而精制品更具

13、有特异性，并且毒性小。胰蛋白酶和链霉蛋白酶解离效果较强，但会造成细胞损伤；相链霉蛋白酶解离效果较强，但会造成细胞损伤；相反，胶原酶和裂解酶解离效果较弱，但对细胞损伤反，胶原酶和裂解酶解离效果较弱，但对细胞损伤较小。透明质酸酶可以与胶原酶合用以消化细胞间较小。透明质酸酶可以与胶原酶合用以消化细胞间基质。脱氧核糖核酸酶可用来分解由破碎细胞释放基质。脱氧核糖核酸酶可用来分解由破碎细胞释放的的DNADNA，因为，因为DNADNA可减弱蛋白水解作用，并促进蛋白可减弱蛋白水解作用，并促进蛋白再聚合。再聚合。24取材(取鼠胚) 1用引颈法杀死动物 2浸入75酒精中5分钟消毒 3开腹取材252627单细胞别离

14、单细胞别离 胰蛋白酶法胰蛋白酶法 适用消化细胞间质适用消化细胞间质较少的软组织，如较少的软组织，如胚胎组织、羊膜、胚胎组织、羊膜、上皮、肝、肾等上皮、肝、肾等 钙离子、镁离子、钙离子、镁离子、血清等都对其有抑血清等都对其有抑制作用。制作用。28 细胞计数 接种培养29原代培养原代培养原代培养本卷须知原代培养本卷须知 虽然各种细胞培养需要满足不同的条虽然各种细胞培养需要满足不同的条件，但有几种条件是大多数原代培养共同需件，但有几种条件是大多数原代培养共同需要的：在取材时需去除脂肪和坏死的组织；要的：在取材时需去除脂肪和坏死的组织；为减小对组织的损伤，需用锋利的器具；为减小对组织的损伤，需用锋利的

15、器具；适度离心以去除用于解离的酶；由于原适度离心以去除用于解离的酶；由于原代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度；营养丰富的培养基如细胞密度；营养丰富的培养基如Hams Fl2比单一的培养基比单一的培养基(如，如，EaglesMEM)更更可取；胚胎组织在原代培养中更易别离，可取；胚胎组织在原代培养中更易别离，细胞较易存活，增殖速度较快，故比成年组细胞较易存活，增殖速度较快，故比成年组织更可取。织更可取。 30传代培养传代培养随着原代培养物培养时间的延长、细胞分裂随着原代培养

16、物培养时间的延长、细胞分裂增殖的进行，培养物体积或密度会越来越大，增殖的进行，培养物体积或密度会越来越大，一方面可能会长满培养空间，另一方面分裂一方面可能会长满培养空间，另一方面分裂增殖的细胞会互相接触而发生增殖的细胞会互相接触而发生接触性抑制接触性抑制，生长速度逐渐减慢甚至停止。生长速度逐渐减慢甚至停止。 31接触抑制接触抑制定义：细胞从接种定义：细胞从接种到长满底物外表后，到长满底物外表后，由于细胞繁殖数量由于细胞繁殖数量增多相互接触后，增多相互接触后，不再增加。不再增加。32传代培养传代培养将细胞培养物分割成小的局部，重新接种到将细胞培养物分割成小的局部，重新接种到另外的培养器皿内，再进

17、行培养，这个过程另外的培养器皿内，再进行培养，这个过程就称为传代培养就称为传代培养(passage culture)。 原那么上，传代是以原代培养物帖壁生原那么上，传代是以原代培养物帖壁生长长满培养器皿的生长面或者在悬浮培养状长长满培养器皿的生长面或者在悬浮培养状态下细胞密度足够大时进行，但传代的具体态下细胞密度足够大时进行，但传代的具体时间并没有固定的时间，操作者可以根据具时间并没有固定的时间，操作者可以根据具体情况安排传代时间。但是，提前或推后传体情况安排传代时间。但是，提前或推后传代都不可取，尤其是后者。代都不可取，尤其是后者。 33传代培养传代培养贴壁培养贴壁培养(1)原代培养物或传代

18、细胞形成细胞单层后，倒原代培养物或传代细胞形成细胞单层后，倒掉旧培养液。掉旧培养液。(2)用用PBS或或PE(含有含有0.02% EDTA的的PBS)洗细胞洗细胞单层单层12次，以洗去死细胞和残存的培养液。次，以洗去死细胞和残存的培养液。(3)消化：消化：0.25%胰蛋白酶溶液和胰蛋白酶溶液和0.02%的的EDTA 37条件下消化条件下消化515 min (4)消化完成时，吸去或者倾出消化液，立即参消化完成时，吸去或者倾出消化液，立即参加蛋白酶抑制剂或者有血清培养液。加蛋白酶抑制剂或者有血清培养液。 34传代培养传代培养贴壁培养贴壁培养(5)离心离心(1000 rmin，5 min)，除去上清

19、含酶溶，除去上清含酶溶液。液。(6)用培养液将细胞沉淀重新悬浮，计数并调整细用培养液将细胞沉淀重新悬浮，计数并调整细胞密度。胞密度。(7)接种在新的培养瓶皿内。一般接种在两个或者接种在新的培养瓶皿内。一般接种在两个或者多个培养瓶皿内。有时候，传代仅为了使培养物多个培养瓶皿内。有时候，传代仅为了使培养物经历并适应传代处理过程，在培养物细胞数量不经历并适应传代处理过程，在培养物细胞数量不大的情况下，传代时还只是接种在一个培养瓶皿大的情况下，传代时还只是接种在一个培养瓶皿内。内。(8)分别补加培养液后，送入培养箱中继续培养。分别补加培养液后，送入培养箱中继续培养。 35细胞贴壁过程细胞贴壁过程36细

20、胞计数细胞计数原理原理 细胞计数结果以细胞数细胞计数结果以细胞数/毫升表示。细胞计数的毫升表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。在细胞群体中总原理和方法与血细胞计数相同。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中别离细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中别离细胞一般也要检查活力，以了解别离的过程对细胞胞一般也要检查活力，以了解别离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。了解冻存和复苏的效果。 用台盼兰用台盼兰(trypa

21、n blue)染细胞，死细胞着色，染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反响，利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反响，也可测定细胞相对数和相对活力。也可测定细胞相对数和相对活力。37细胞计数细胞计数仪器、用品与试剂仪器、用品与试剂1 1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管吸管2 2、试剂：台盼兰、试剂：台盼兰( (台盼兰克加双蒸水至台盼兰克加双蒸水至100ml)100ml)3 3、材料：细胞悬液、材料：细胞悬液( (细胞悬液的制备：用毛吸

22、管吸细胞悬液的制备：用毛吸管吸5 5滴细胞悬液到一小试管中，参加滴细胞悬液到一小试管中，参加1 1滴台盼蓝染液滴台盼蓝染液，混匀，静置，混匀，静置2 23min,3min,活细胞不会被染色，活细胞不会被染色，而死细胞着蓝色，这样参加染液后就可以在显微镜而死细胞着蓝色，这样参加染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。下区别活细胞和死细胞。) )38细胞计数细胞计数操作步骤操作步骤 1 1、将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净，、将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净，并将盖片盖在计数板上。并将盖片盖在计数板上。 2 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液

23、充满盖片和计数板使悬液充满盖片和计数板 之间。之间。 3 3、静置、静置3 3分钟。分钟。 4 4、镜下观察，然后按下式计算：、镜下观察，然后按下式计算：细胞悬液的细胞数细胞悬液的细胞数/ml/ml 四个大格子四个大格子细胞数细胞数/4)/4)稀释倍数稀释倍数104 /ml104 /ml39细胞计数要点：细胞计数要点： 4 4个个/ml/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；少量培养液中；2.2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否要求细胞悬液中的细胞分散良好，否那么影响计数准确性。那么影响计数准确性。 40细胞计数细胞计数细胞计数要点：细胞计数要

24、点： 3.3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时屡次取样计数时取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时屡次取样计数时更意每次取样都要混匀，以求计数准确；更意每次取样都要混匀，以求计数准确； 4.4.数细胞的原那么是只数完整的细胞，假设细胞聚集成团时只数细胞的原那么是只数完整的细胞，假设细胞聚集成团时只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，那么只计上线，按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，那么只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。不计下线，只计左线，不计右线。 5.5.操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否那么要重

25、新计数。中，否那么要重新计数。 41细胞计数细胞计数初学者易犯的错误：初学者易犯的错误： 1. 1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。计数前未将待测悬液吹打均匀。 2. 2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。 3. 3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽 中。中。42传代培养传代培养悬浮培养悬浮培养适用细胞：血细胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞适用细胞：血细胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞(包括杂交瘤细胞包括杂交瘤细胞)以及某些转化细胞。以及某些转化细胞。方法：不用消化液方法：不用消化液 停止摇动停止摇动 吸出局部细胞吸出

26、局部细胞 补加培养液补加培养液 43动物细胞培养的根本方法动物细胞培养的根本方法体外培养这门技术，说到底就是将活的组织、细体外培养这门技术，说到底就是将活的组织、细胞、器官或者微小个体放在一个不会被其他微生胞、器官或者微小个体放在一个不会被其他微生物污染的培养器皿内而维持其生存、生长的技术。物污染的培养器皿内而维持其生存、生长的技术。既然如此，由于拟培养的对象不同、拟放置的培既然如此，由于拟培养的对象不同、拟放置的培养器皿不同以及维持生存与生长的方法不同，体养器皿不同以及维持生存与生长的方法不同，体外培养就可分为许多不同的方法或技术。外培养就可分为许多不同的方法或技术。 44动物细胞培养的根本

27、方法动物细胞培养的根本方法 悬滴培养法悬滴培养法 培养瓶培养法培养瓶培养法 旋转管培养法旋转管培养法 灌注小室培养法灌注小室培养法 培养板培养法培养板培养法45单盖玻片悬滴培养法单盖玻片悬滴培养法 将培养液滴于盖玻片将培养液滴于盖玻片上并铺展开上并铺展开 将待培养的组织块铺将待培养的组织块铺展于培养液中央展于培养液中央 将盖玻片翻转放于凹将盖玻片翻转放于凹载玻片上，密封载玻片上，密封 贴壁贴壁2424小时内，细胞小时内，细胞就能从组织块四周游走就能从组织块四周游走 适用于组织量少的适用于组织量少的原代原代培养培养46单玻片的再培养单玻片的再培养 1 1用消毒剃须刀刮去盖玻片用消毒剃须刀刮去盖玻

28、片四周的石蜡四周的石蜡 2 2用镊子小心揭开盖玻片，用镊子小心揭开盖玻片，培养物面朝上，放入培养皿培养物面朝上，放入培养皿内。内。 3 3用白内障刀切除生长晕周用白内障刀切除生长晕周围局部，留下方形培养物，围局部，留下方形培养物，并切成小块。并切成小块。 4 4将小块在含有平衡盐溶液将小块在含有平衡盐溶液的培养皿中再漂洗，移入另的培养皿中再漂洗，移入另一含有平衡盐溶液的培养皿一含有平衡盐溶液的培养皿内，进行再培养。内，进行再培养。47双盖玻片悬滴培养法双盖玻片悬滴培养法 方法和前面根本相同。不同点：取一载体盖玻片，在其方法和前面根本相同。不同点：取一载体盖玻片，在其上滴一滴大小适当的消毒蒸馏水

29、。将带有组织块的盖玻上滴一滴大小适当的消毒蒸馏水。将带有组织块的盖玻片的无组织一面贴到载体盖玻片上，借助水滴的扩展，片的无组织一面贴到载体盖玻片上，借助水滴的扩展，将两张盖玻片贴牢在一起。将两张盖玻片贴牢在一起。 培养两天后，将带有培养物的盖玻片取下，漂洗后将其培养两天后，将带有培养物的盖玻片取下，漂洗后将其贴于一张新的载体盖玻片上，继续培养。贴于一张新的载体盖玻片上，继续培养。 优点：优点：1 1容易换片。容易换片。2 2培养物在培养过程中，不需移培养物在培养过程中，不需移动位置，有利于组织分化。动位置，有利于组织分化。48培养瓶培养法培养瓶培养法 器材：器材：培养瓶培养瓶 材料：材料：组织

30、块或单层细胞组织块或单层细胞 方法：方法：单层细胞用消化培单层细胞用消化培养法，将组织消化成为细养法，将组织消化成为细胞悬液后培养胞悬液后培养 组织块以间距均匀摆置在组织块以间距均匀摆置在瓶壁上，翻转瓶，注入适瓶壁上，翻转瓶，注入适宜培养液，宜培养液，3737恒温恒温2424小时，待贴附后，再翻转小时，待贴附后，再翻转平放，静置培养。平放，静置培养。49培养瓶传代培养培养瓶传代培养50旋转管培养法旋转管培养法 器材：旋器材：旋转管，旋转管，旋转瓶转瓶 由于旋转由于旋转作用，组作用，组织块和细织块和细胞交替地胞交替地与培养基与培养基和空气直和空气直接接触。接接触。51灌注小室培养法灌注小室培养法

31、 基于悬基于悬滴培养滴培养建立的建立的方法，方法，可用来可用来连续观连续观察的细察的细胞的动胞的动态变化态变化52培养板培养法培养板培养法 用于对培养物进行标准的、定量的组间比较。用于对培养物进行标准的、定量的组间比较。53动物细胞体外培养的生物学特性动物细胞体外培养的生物学特性 由于体内和体外环境不同，培养细由于体内和体外环境不同，培养细胞的生物特性有所不同。在培养细胞的生物特性有所不同。在培养细胞期间，要对细胞进行常规性检测。胞期间，要对细胞进行常规性检测。 细胞形态、细胞生长状况、营养液、细胞形态、细胞生长状况、营养液、微生物污染等方面进行检查。微生物污染等方面进行检查。54动物细胞体外

32、培养的生物学特性动物细胞体外培养的生物学特性 在细胞机能不良时，轮廓增强，胞质中在细胞机能不良时，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴和其它颗粒状物，细常出现空泡、脂滴和其它颗粒状物，细胞之间空隙加大，细胞形态可以变得不胞之间空隙加大，细胞形态可以变得不规那么甚至失去原有特点，如上皮细胞规那么甚至失去原有特点，如上皮细胞变成成纤维细胞等。可利用活细胞相差变成成纤维细胞等。可利用活细胞相差显微镜观察并摄影其一般形态结构、超显微镜观察并摄影其一般形态结构、超微结构和细胞骨架等。微结构和细胞骨架等。55动物细胞体外培养的生物学特性动物细胞体外培养的生物学特性 体外培养的细胞，按照其生长方式大体体外培养的

33、细胞，按照其生长方式大体可分为可分为贴壁依赖性贴壁依赖性(黏附型黏附型)和和非贴壁依赖非贴壁依赖性性(悬浮型悬浮型)两大类。两大类。 贴壁依赖性细胞分四类：贴壁依赖性细胞分四类：成纤维细胞型、成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型和多形细胞型上皮细胞型、游走细胞型和多形细胞型 56细胞体外生长形态细胞体外生长形态 成纤维细胞型成纤维细胞型 细胞呈梭形、长条形、多角形或不规细胞呈梭形、长条形、多角形或不规那么形，细胞之间排列疏松，有较大细胞间那么形，细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙，有时也见平行排列，成群细胞呈现放射隙，有时也见平行排列，成群细胞呈现放射状、旋涡状等走行形式。起源于中胚层的细状、旋

34、涡状等走行形式。起源于中胚层的细胞在体外培养时一般表现这种形式，例如成胞在体外培养时一般表现这种形式，例如成纤维细胞以及其他主要的结缔组织细胞、心纤维细胞以及其他主要的结缔组织细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、胶质细胞、肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、胶质细胞、胚胎间充质细胞等多呈此型。在体外培养动胚胎间充质细胞等多呈此型。在体外培养动物细胞时，经常遇到培养物中出现成纤维细物细胞时，经常遇到培养物中出现成纤维细胞型的细胞，因确切类型不明，一般称之为胞型的细胞，因确切类型不明，一般称之为成纤维细胞样细胞成纤维细胞样细胞(fibroblast-like cell)。 57细胞体外生长形态细胞体外

35、生长形态 成纤维细胞型成纤维细胞型 58贴壁依赖性细胞贴壁依赖性细胞 596061贴壁依赖性细胞贴壁依赖性细胞 上皮细胞型上皮细胞型 细胞呈扁平，形态较为规整，细胞大细胞呈扁平，形态较为规整，细胞大致为多边形，胞体近中央处有扁圆的细胞核；致为多边形，胞体近中央处有扁圆的细胞核；细胞之间相互衔接或呈镶嵌状紧密排列；当细胞之间相互衔接或呈镶嵌状紧密排列；当细胞紧密排列时，细胞可为六角形或多角形，细胞紧密排列时，细胞可为六角形或多角形，因为相互拥挤而呈现因为相互拥挤而呈现“铺路石样上皮型细铺路石样上皮型细胞并不等于动物体内上皮组织的细胞。起源胞并不等于动物体内上皮组织的细胞。起源于内胚层和外胚层的细

36、胞，体外培养时都有于内胚层和外胚层的细胞，体外培养时都有可能呈现上皮型。例如皮肤表皮细胞、消化可能呈现上皮型。例如皮肤表皮细胞、消化管与呼吸道的上皮细胞、肺泡上皮细胞、消管与呼吸道的上皮细胞、肺泡上皮细胞、消化腺上皮细胞、血管内皮细胞、肝脏细胞、化腺上皮细胞、血管内皮细胞、肝脏细胞、胰脏细胞以及上皮源性的鳞癌细胞等。胰脏细胞以及上皮源性的鳞癌细胞等。62贴壁依赖性细胞贴壁依赖性细胞 上皮细胞型上皮细胞型63贴壁依赖性细胞贴壁依赖性细胞 64贴壁依赖性细胞贴壁依赖性细胞 游走细胞型游走细胞型 细胞形态不稳定，相互散在生长，一般细胞形态不稳定，相互散在生长，一般不形成群落；细胞内易出现色暗的吞噬性

37、颗不形成群落；细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒，常具有胞质突起粒，常具有胞质突起( (伪足伪足) )。这类细胞在培。这类细胞在培养器皿壁上生长的位置不固定，常活泼地游养器皿壁上生长的位置不固定，常活泼地游走或做变形运动，速度快且方向不规那么，走或做变形运动，速度快且方向不规那么，一般不连成片。当细胞密度增大相互连接成一般不连成片。当细胞密度增大相互连接成片时，游走受限，形状上类似上皮型细胞或片时，游走受限，形状上类似上皮型细胞或成纤维型细胞。如颗粒性白细胞、淋巴细胞、成纤维型细胞。如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肝枯否细胞单核细胞、巨噬细胞、肝枯否细胞(Kupffer (Kupffe

38、r cell)cell)以及某些肿瘤细胞等。以及某些肿瘤细胞等。 65贴壁依赖性细胞贴壁依赖性细胞 66贴壁依赖性细胞贴壁依赖性细胞 多形细胞型多形细胞型 多形型细胞是一些形态上不规那么的多形型细胞是一些形态上不规那么的细胞，但它不像成纤维细胞型的细胞那样，细胞，但它不像成纤维细胞型的细胞那样，不规那么形态由宽扁的胞质突起所致。其细不规那么形态由宽扁的胞质突起所致。其细胞一般分胞体和胞突两局部组成，胞体略呈胞一般分胞体和胞突两局部组成，胞体略呈多角形，但无成纤维细胞型那样不规那么；多角形，但无成纤维细胞型那样不规那么；胞突为细长形，似丝状伪足。体外培养的神胞突为细长形，似丝状伪足。体外培养的神

39、经元细胞及神经胶质细胞属于此类，细胞由经元细胞及神经胶质细胞属于此类，细胞由神经元本体和树枝状的树突构成。神经元本体和树枝状的树突构成。67 68非非贴壁依赖性细胞贴壁依赖性细胞 主要形态学特点是胞体始终为球形。主要形态学特点是胞体始终为球形。 优点：能以悬浮状态生长的细胞，密度一般优点：能以悬浮状态生长的细胞，密度一般都可以较大，故培养的效率高。以这种方式都可以较大，故培养的效率高。以这种方式培养细胞时，转换培养液、补加培养液以及培养细胞时，转换培养液、补加培养液以及收获细胞都比较容易。收获细胞都比较容易。 缺乏：不方便观察。缺乏：不方便观察。 69培养培养细胞的生长曲线细胞的生长曲线 生长

40、曲线生长曲线(growth curve)反映的是培养细胞反映的是培养细胞从接种到传代之前的生长增殖情况从接种到传代之前的生长增殖情况 根据接种和每一次传代培养的细胞生长的变根据接种和每一次传代培养的细胞生长的变化过程，一般把每一代细胞的生长过程分为化过程，一般把每一代细胞的生长过程分为潜伏期潜伏期(latent phase)、指数生长期指数生长期(logarithmic growth phase)、平台期平台期(plateau phase)和和衰退期衰退期(senescence phase)四个时期四个时期 70培养培养细胞的生长曲线细胞的生长曲线 1 1潜伏期潜伏期2 2指数生长期指数生长期

41、3 3稳定期稳定期( (平台期平台期) )4 4衰退衰退( (亡亡) )期期71培养培养细胞的生长曲线细胞的生长曲线 潜伏期潜伏期 特点：特点：细胞有生长活动而无细胞分裂。细胞有生长活动而无细胞分裂。 时间：长短与细胞种类、接种的细胞密度、时间：长短与细胞种类、接种的细胞密度、 培养条件等因素有关。原代培养细胞培养条件等因素有关。原代培养细胞 的潜伏期长，为的潜伏期长，为2496 h；细胞系的；细胞系的 潜伏期短，为潜伏期短，为624 h。 72培养培养细胞的生长曲线细胞的生长曲线 指数生长期指数生长期 指数生长期是细胞增生最活泼、细胞指数生长期是细胞增生最活泼、细胞活力最旺盛的阶段，培养物中

42、的细胞数活力最旺盛的阶段，培养物中的细胞数目呈指数增长，进行实验研究一般选择目呈指数增长，进行实验研究一般选择此期细胞。此期细胞。 持续时间：持续时间：35 d 73培养培养细胞的生长曲线细胞的生长曲线 平台期平台期(plateau phase)也称停滞期也称停滞期(stagnatephase)，意即细胞不再分裂增殖，意即细胞不再分裂增殖，细胞数量维持在某一水平上，生长活动停滞。细胞数量维持在某一水平上，生长活动停滞。 特点：细胞仍有代谢活动，但生长活动极为特点：细胞仍有代谢活动，但生长活动极为 缓慢。缓慢。 提示：传代。提示：传代。74传代培养细胞增殖规律传代培养细胞增殖规律a.新传代的单层

43、细胞，传代新传代的单层细胞，传代24 h；b.对数中期细胞，对数中期细胞，传代传代后后3 d，需，需要更换培养液；要更换培养液；c.早平台期细胞，早平台期细胞，传代后传代后7 d，需要再次传代，需要再次传代。abc75培养培养细胞的生长曲线细胞的生长曲线 衰退期衰退期 由于没有及时传代，培养液中营养物质耗由于没有及时传代，培养液中营养物质耗尽，代谢废物累积，尽，代谢废物累积，pH值降低，使细胞发生值降低，使细胞发生中毒性改变，甚至脱落死亡。也就是进入了中毒性改变，甚至脱落死亡。也就是进入了衰退期。衰退期。 衰退期不同于细胞的停滞期。处于停滞期的衰退期不同于细胞的停滞期。处于停滞期的细胞可通过传

44、代进行挽救，而处于衰退期的细胞可通过传代进行挽救，而处于衰退期的细胞以任何方法都不能阻止其向死亡方向开细胞以任何方法都不能阻止其向死亡方向开展。展。76培养细胞常规检查和特性鉴定培养细胞常规检查和特性鉴定 污染：与培养无关的杂质混入培养污染：与培养无关的杂质混入培养系统称为污染系统称为污染(contamination)。包括各类微生物的污染、各种培养包括各类微生物的污染、各种培养物间的交叉污染和化学物质的污染。物间的交叉污染和化学物质的污染。后两种污染比较容易预防，而微生后两种污染比较容易预防，而微生物污染的预防及处理就比较困难，物污染的预防及处理就比较困难，它能直接影响后续研究工作。它能直接

45、影响后续研究工作。 77培养细胞常规检查培养细胞常规检查 培养液培养液pH值值 偏酸偏酸黄；中性黄；中性樱桃红色；偏碱樱桃红色；偏碱深深红色红色 提示提示 变黄的情形有两种：一种是变黄的情形有两种：一种是CO2；另一；另一种情形是由于污染的细菌或霉菌的大量种情形是由于污染的细菌或霉菌的大量生长，从而使培养液变黄变混浊。生长，从而使培养液变黄变混浊。78培养细胞常规检查培养细胞常规检查 细胞健康状况细胞健康状况 良好：透明度大，细胞内颗粒少，没有良好：透明度大，细胞内颗粒少，没有空泡，胞膜清晰，培养上清清澈透明空泡，胞膜清晰，培养上清清澈透明 不良：胞质中常出现空泡、脂滴和其它不良：胞质中常出现

46、空泡、脂滴和其它颗粒状物，细胞之间空隙加大，细胞形颗粒状物，细胞之间空隙加大，细胞形态可变得不规那么甚至失去原有特点。态可变得不规那么甚至失去原有特点。79培养细胞常规检查培养细胞常规检查 微生物污染及其排除微生物污染及其排除 微生物污染途径微生物污染途径 a.空气：空气流动性大，如隔离不严，易造成空气：空气流动性大，如隔离不严，易造成不洁空气的污染。不洁空气的污染。 b.培养液：配制过程发生污染。培养液：配制过程发生污染。 c.操作：无菌观念不强。操作：无菌观念不强。 d.血清：质量不好、检查不严。血清：质量不好、检查不严。 e.组织样本：防止用碘消毒、内源性病毒。组织样本：防止用碘消毒、内

47、源性病毒。80培养细胞常规检查培养细胞常规检查 微生物污染及其排除微生物污染及其排除 细菌污染细菌污染 观察观察：污染较轻：污染较轻培养液清亮；污染严培养液清亮；污染严 重时重时培养液变混浊培养液变混浊 检测检测：去培养液肉：去培养液肉汤汤培养或涂板培养或涂板排除排除：抗生素：抗生素(常用量的常用量的5-10倍倍)；丢弃；丢弃81培养细胞常规检查培养细胞常规检查 微生物污染及其排除微生物污染及其排除 真菌污染真菌污染(酵母菌和霉菌酵母菌和霉菌)酵母菌污染酵母菌污染类似细菌。观察到圆形或卵圆形类似细菌。观察到圆形或卵圆形 的酵母菌且可闻到像酒或酸的发的酵母菌且可闻到像酒或酸的发 酵样异味。酵样异

48、味。霉菌霉菌显微镜观测显微镜观测 82培养细胞常规检查培养细胞常规检查 微生物污染及其排除微生物污染及其排除 支原体污染支原体污染 特点：培养液不混浊，多数细胞无明显变化，特点：培养液不混浊，多数细胞无明显变化，生长缓慢，严重时细胞脱壁死亡。生长缓慢，严重时细胞脱壁死亡。 检测：光学显微镜；地衣红染色；荧光法。检测：光学显微镜；地衣红染色；荧光法。 排除：热处理排除：热处理4141，5-10h5-10h。；巨噬细胞。；巨噬细胞吞吞 噬法；动物体内接种法。噬法；动物体内接种法。83培养细胞常规检查培养细胞常规检查 微生物污染及其排除微生物污染及其排除 病毒污染病毒污染 要判断培养细胞是否被病毒污

49、染，还可要判断培养细胞是否被病毒污染，还可以应用电子显微镜观察或用商品化的试剂进以应用电子显微镜观察或用商品化的试剂进行免疫学染色行免疫学染色 。84培养细胞常规检查培养细胞常规检查 微生物污染及其排除 85培养细胞常规检查培养细胞常规检查 细胞交叉污染细胞交叉污染 化学物质污染化学物质污染 86细胞系鉴定的方法细胞系鉴定的方法 细胞系细胞系(Cell Line)(Cell Line)：原代培养后经首次传代：原代培养后经首次传代成功即成细胞系成功即成细胞系 。 细胞株细胞株(Cell Strain)(Cell Strain)：把一个单细胞从一个：把一个单细胞从一个群体中别离出来单独培养，使之重

50、新繁衍成群体中别离出来单独培养，使之重新繁衍成为一个新的细胞群体。为一个新的细胞群体。87细胞系鉴定的方法细胞系鉴定的方法 细胞系的演化细胞系的演化 原代培养阶段原代培养阶段有限细胞系阶段有限细胞系阶段连续细胞系阶段连续细胞系阶段 细胞系的转化细胞系的转化 88细胞系鉴定的方法细胞系鉴定的方法 形态学分析形态学分析 形态学分析是一种最简单最直接的细胞系鉴形态学分析是一种最简单最直接的细胞系鉴定方法定方法 要求：相同的培养液、相同的细胞密度、相要求：相同的培养液、相同的细胞密度、相 同的生长阶段同的生长阶段 89细胞系鉴定的方法细胞系鉴定的方法 细胞生长情况的分析细胞生长情况的分析 生长曲线生长

51、曲线：可测知细胞倍增时间。：可测知细胞倍增时间。 分裂指数分裂指数：用以表示细胞增殖旺盛程度。即：用以表示细胞增殖旺盛程度。即每每100100个细胞中处于分裂相的细胞所占的比个细胞中处于分裂相的细胞所占的比例。例。 分裂指数分裂指数= =分裂细胞数分裂细胞数/ /总细胞数总细胞数100% 100% 集落形成率或克隆形成率集落形成率或克隆形成率：反映细胞独立生：反映细胞独立生存能力存能力90细胞系鉴定的方法细胞系鉴定的方法 染色体分析染色体分析 不同生物的体细胞染色体各有其一定的数目、不同生物的体细胞染色体各有其一定的数目、形状和结构，而且这些特征在其正常细胞周形状和结构，而且这些特征在其正常细

52、胞周期和生命周期过程中保持稳定。期和生命周期过程中保持稳定。91细胞系鉴定的方法细胞系鉴定的方法 同工酶分析同工酶分析 原因：同工酶是指同一种属中由不同基因位原因：同工酶是指同一种属中由不同基因位点或同一位点的复等位基因编码的多肽链所点或同一位点的复等位基因编码的多肽链所组成的单体、同聚体或杂聚体。同工酶具有组成的单体、同聚体或杂聚体。同工酶具有种属特异性、发育特异性及组织特异性。种属特异性、发育特异性及组织特异性。 方法：从不同种属动物细胞来源的细胞系制方法：从不同种属动物细胞来源的细胞系制备的细胞抽提液，分析同工酶的酶谱，会显备的细胞抽提液，分析同工酶的酶谱，会显示各自的典型带型。这些带型

53、可作为细胞系示各自的典型带型。这些带型可作为细胞系的特征指标，用来检查细胞系细胞以及细胞的特征指标，用来检查细胞系细胞以及细胞系的来源。系的来源。 92细胞系鉴定的方法细胞系鉴定的方法 细胞谱系或组织的遗传标记分析细胞谱系或组织的遗传标记分析 细胞细胞DNADNA遗传特征分析遗传特征分析 93细胞同步化细胞同步化 概念：使细胞群中的绝大局部细胞概念：使细胞群中的绝大局部细胞“聚集聚集在细胞周期的同一时期，并使之同步进入细在细胞周期的同一时期，并使之同步进入细胞周期，这样的方法称为细胞同步化胞周期，这样的方法称为细胞同步化cell cell synchronizationsynchronizat

54、ion。 意义：可获得大量同周期阶段的细胞，从而意义：可获得大量同周期阶段的细胞，从而对其进行生化分析，深入了解细胞周期各个对其进行生化分析，深入了解细胞周期各个不同阶段细胞的结构与功能，以及研究细胞不同阶段细胞的结构与功能，以及研究细胞周期中有关基因的调控与表达等周期中有关基因的调控与表达等 94细胞同步化细胞同步化 方法：别离同步化方法：别离同步化 诱导同步化诱导同步化 95细胞同步化细胞同步化 1.1.别离同步化别离同步化 (1) G1 (1) G1、 G2 G2、 S S期细胞的别离期细胞的别离 细胞分类拣选法细胞分类拣选法 梯度沉降法梯度沉降法 (2)M (2)M期细胞的别离期细胞的

55、别离 胰蛋白酶消化法胰蛋白酶消化法 振摇脱落法振摇脱落法96细胞同步化细胞同步化 2.2.诱导细胞同步化诱导细胞同步化 (1) G1 (1) G1期细胞的别离期细胞的别离 a a、低温处理法、低温处理法 (4,2-10h (4,2-10h。) ) d d、营养饥饿法、营养饥饿法 (2) M (2) M期细胞的诱导与别离期细胞的诱导与别离 秋水仙素秋水仙素( (终浓度终浓度1 1g/mL)g/mL) 秋水仙胺秋水仙胺( (终浓度终浓度g/mL) g/mL) 97细胞冷冻细胞冷冻 细胞冻存：在培养液中参加保护剂甘油细胞冻存：在培养液中参加保护剂甘油或二甲基亚砜或二甲基亚砜DMSODMSO, ,浓度

56、在浓度在10102020之间，可以降低冰点，在缓慢的冻结条之间，可以降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。在胞外。在-196-196的液氮中可长期保存。的液氮中可长期保存。98要点要点 用慢冻快融的方法：标准的冷冻速度为用慢冻快融的方法：标准的冷冻速度为-1-1- -2/2/分，当温度达分，当温度达- 25- 25时，下降率可增至时，下降率可增至- -55至至-10/-10/分，到分，到-100-100度时，那么可迅速浸度时，那么可迅速浸入液氮中。要适当掌握下降速度，过快会影入液氮中。要适当掌握下降速度，过快会影响细胞内水分透出，太慢

57、那么促进冰晶形成，响细胞内水分透出，太慢那么促进冰晶形成，但各种细胞对冻结速度要求也不一样。总之，但各种细胞对冻结速度要求也不一样。总之，在一开始时，下降速度不能超过在一开始时，下降速度不能超过-10/-10/分钟。分钟。 最好冻存一年后，再复苏培养一次，然后再最好冻存一年后，再复苏培养一次，然后再继续冻存。继续冻存。99冻存过程冻存过程100器官培养器官培养 意义和目的意义和目的 由于其可以在体外维持器官的三维结构和特定由于其可以在体外维持器官的三维结构和特定的功能，消除了体内复杂的体液和神经等因素的影的功能，消除了体内复杂的体液和神经等因素的影响，有利于独立研究某一器官的功能活动、分析影响，有利于独立研究某一器官的功能活动、分析影响器官功能的因素、了解器官内部不同组织间的相响器官功能的因素、了解器官内部不同组织间的相互作用；器官原基的培养，又可以使我们能更直接互作用；器官原基的培养，又可以使我们能更直接地观察和研究器官的形态发生、细胞分化等生命活地观察和研究器官的形态发生、细胞分化等生命活动，这是细胞培养所无法替代的。动，这是细胞培养所无法替代的。 101器官培养器官