第二章第七节微生物限度检查

1、第七节 微生物限度检查主讲人:刘代群壹壹 微生物限度检查对环境和设备的要求微生物限度检查对环境和设备的要求贰贰 微生物限度检查的基本步骤微生物限度检查的基本步骤叁叁 细菌真菌及酵母菌的计数细菌真菌及酵母菌的计数 肆肆 控制菌检查控制菌检查伍伍 结果判断结果判断陆陆 微生物限度标准微生物限度标准 检查药典规定的非规定灭菌制剂及其原料,辅料受微生物污染程度的检查.是体现药品卫生质量的重要指标,是药品生产企业管理和安全性评价的重要手段和依据之一. 检查项目: 细菌数 真菌数 酵母菌数 控制菌数一一 微生物限度检查对环境和设备的要求微生物限度检查对环境和设备的要求1.环境洁净度10000级以下的局部洁

2、净度在100级的单向流空气区域,无菌操作,防止再污染.2.供试品包装完好,未开启,阴凉干燥处放置.3.表面活性剂,中和剂或灭菌剂应证明有效性及对微生物生长和存活无影响.4.细菌培养温度3035;真菌培养温度2328;控制菌培养温度3537.5.检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10c 为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。二二 微生物限度检查的基本步骤微生物限度检查的基本步骤(1）抽验量和检验量 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml 或c）。除另有规定外，一般供试品的检验量为10g 或10ml；化学膜剂为100c；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，

3、其检验量应增加20g 或20ml（其中10g或者10ml 用于阳性对照试验）。 随机抽样，抽样量至少为检验用量（2 个以上最小包装单位）的3倍，供试品，膜剂还不得少于4 片。（二）供试液的制备供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45，时间不得超过30分钟。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1 小时。常用供试液的制备方法1。一般供试品的供试液制备取供试品10g或10ml，加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1 10 的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80 使供试品分散均匀。水溶

4、性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。2。特殊供试品的供试液制备（1）乳膏和软膏：取供试品5g（或5ml），加至含溶化的（温度不超过45）5g 司盘80、3g 单硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯80 无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1 20 的供试液。（2）油膏及栓剂取供试品10g，加至含20ml 无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇510 分钟，萃取，静

5、置使油水明显分层，取其水层作为1 10 的供试液。 (3)膜剂供试品 取供试品100c，剪碎，加100ml 的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（必要时可增加稀释液），浸泡，振摇，作为1 10 的供试液。 (4)肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10g，加pH6.8 无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或pH7.6 无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45水浴中，振摇，使溶解，作为1 10 的供试液。(5)气雾剂、喷雾剂供试品 取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1 小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器

6、吸出全部药液，加至适量的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml 的供试品，再稀释成1 10 的供试液。(6)贴膏剂供试品 取规定量供试品，去掉贴膏剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯80 或卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少30 分钟，制成供试液。贴膏剂也可以其他适宜的方法制备成供试液。3 具抑菌活性的供试品 当供试品有抑菌活性时，采用下列方法进行处理，以消除供试液的抑菌活性后，再依法检

7、查。常用的方法如下：培养基稀释法： 取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml，每1ml 供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每1ml 供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml 供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。 离心沉淀法 取一定量的供试液， 500 转/分离心3 分钟，取全部上清液混合，用于细菌检查。薄膜过滤法 见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑

8、菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。三 细菌 真菌 酵母菌的计数 细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。（一）计数方法的验证 当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌，真菌，及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌，真菌及酵母菌数的测定。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。验证时，按供试液的制备和细菌，真菌及酵母菌计数所规定的方法及相关要求进行。对各试验菌的回收率应逐一验证。1 验证试验用菌种

9、菌种试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代）。应采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 003枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC（B） 63 501白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F） 98 0032 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培

10、养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养1824 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养2448 小时。 培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数为50100cfu 的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养57 天，加入35ml 含0.05%（v/v）聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（v/v）聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50100cfu 的孢子悬液。菌悬液在室温下放置应在2 小时内使用，若保存在28可在24 小时

11、内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28，在验证过的贮存期内使用。 适用性检查 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，混匀，凝固，置3035培养48 小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各50100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置2328培养72 小时，计数；取白色念珠菌50100cfu，注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，平行制备2 个平皿，混匀，凝固，置2328培养72 小时，计数。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基

12、进行上述试验。3 验证方法 （1）试验组 平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml 和50100cfu 试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。（2）菌液组 测定所加的试验菌数。（3）供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。（4）稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度

13、。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml 供试液含50100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。（5)结果判断 在3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性

14、，并重新进行方法验证。（二 ）检查法 按已验证的计数方法进行供试品的细菌,真菌及酵母菌菌数的测定.取验证的方法制备的均匀供试液,用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1：10，1：100，1：1000等稀释级。1 平皿计数法 （1） 在上述进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取该稀释级供试液各1ml至每个直径90mm的灭菌平皿中，或从高稀释级至低稀释级吸液时可用1支吸管吸供试液各1ml至每个灭菌平皿中。每一稀释级每种培养基至少注23个平皿（一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。 （2 ）阴性对照 待

15、各级稀释液注皿完毕后，用1支1ml吸管吸取试验用稀释剂（pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液）各1ml，分别注入4个平皿中。其中2个作细菌数阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另用YPD琼脂测定酵母菌数时，则再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照。 （3 ）倾注培养基 ： 将预先配制好的细菌计数用的营养琼脂培养基；霉菌、酵母菌计数用的玫瑰红钠琼脂培养基；含蜂蜜、王浆液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌）和YPD琼脂培养基（酵母菌）熔化，冷至约45时，倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速旋转平皿，使供试液或稀释液与培养基混匀，盖上陶瓦盖，或半盖盖，除去冷凝水后，再移去陶瓦盖后，盖上平皿盖

16、置操作平台上待凝。在旋转平皿时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上。 （4 ）培养 ：细菌计数平板倒置于3035培养箱中培养3天。霉菌、酵母菌计数平板倒置于2328培养箱中培养5天，必要时延长至7天。逐日观察菌落生长情况，点计菌落数。 （5） 菌落计数 u 一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落之间，以及菌落与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡、油滴等的区别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察，或挑取可疑物涂片镜检。 n 供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点计在细菌

17、、霉菌和酵母菌数内。排除的方法需按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。 供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，培养基注皿后亦可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多的有形物，且难与菌落相区别。为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿（12个平皿）。注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中。在计数菌落时作为对照。或用含TTC营养琼脂注皿，经培养后该培养基生长的菌落为红色，衬于白色背景上易于点计细菌菌落和区分其他有形物。有些软膏等非水溶性供试品，经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌落不易辨认和点计，为防止这种情况，也可用含TTC营养琼脂注皿。TTC的用量应以不抑

18、制微生物生长为宜，通常使用的浓度为0.001。 u 若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个或2个以上菌落计数；若平板生长有链状或片状、云雾状菌落，菌落间无明显界线，一条链、片作为一个菌落计，但若链、片上出现性状与链、片状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延的较大的片状菌落或花斑样菌落，其外缘有若干性状相似的单个菌落，一般不宜作为计数用。 u菌落生长呈蔓延趋势者，细菌需在24h，霉菌需在48h做初步点计（点计霉菌菌落时，轻轻翻转平板，勿反复翻转，否则使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，导致计数误差）。 u在培养3天点计细菌，培养5天点计霉菌时，如菌

19、落极小，不易辨认，细菌计数可延长培养时间至5天；霉菌及酵母菌计数可延长培养时间至7天，再点计菌落数。u 对有异议的供试品以YPD培养基作酵母菌计数时，可培养至1周再点计菌落数。 u含蜂蜜、王浆液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基点计霉菌数，YPD琼脂培养基点计酵母菌数。两者合并计数。 u在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数多的培养基中的菌数为计数结果。 （1 ）薄膜过滤法

20、主要起到富集微生物、分离去除样品中对微生物生长产生干扰的因素的作用，可以有效提高检查结果的灵敏度和可靠性，是近年来微生物检查领域中日益广泛应用的一种技术手段。 （2 ）薄膜过滤法采用的滤膜孔径应不大于0.45um。滤膜直径一般为50mm，为便于计数，以及减轻供试液堵塞滤膜的情况，在便于操作的前提下，可以选用直径更大的滤膜或薄膜过滤器。采用不同直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。 2 薄膜过滤法 （3 ）水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试

21、品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，以滤膜直径为50mm的滤膜计，每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，总冲洗量不得超过1000ml；其他直径的滤膜及薄膜过滤器可按膜面积比例调整，总的原则是避免大体积、过高流速的冲洗造成滤膜上的微生物受损伤。 （4） 由于供试液中一些不能通过滤膜的颗粒存在，常常造成滤膜堵塞、压力升高，严重情况时可能发生过滤装置炸裂造成安全事故或实验室污染；也可能发生由于压力过大滤膜开裂或滤膜孔径变大，造成滤膜对微生物的过滤截留失败。所以，实际操作中应考虑对薄膜过

22、滤中的压力控制和设备的安全性，设置一定的安全压力限度，例如滤膜两侧压差不得过50psi。具体压力限度应根据具体薄膜过滤装置及滤膜确定。 （5 ）采用适当方法去除供试液中的颗粒（前提是不能影响微生物的回收率）、适当增加薄膜面积或降低过滤液体流速可以有效降低滤膜两侧的压力差。 （6 ）取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每1g、1ml或10cm2所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml，过滤。用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜.冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡

23、萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则影响微生物生长。 （7 ）贴膏剂宜采用薄膜过滤法进行细菌、霉菌及酵母菌计数。 （8 ）阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。 （9 ）培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过100cfu。 （10） 菌数报告规则 以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以1报告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml或10cm2供试品），或1乘以最低稀释倍数的值报告菌数 10.1.6 菌数报告规则 10.1.6.

24、1 宜选取细菌、酵母菌平均菌落数小于300cfu、霉菌菌落数平均数小于100cfu的平板计数作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。 10.1.6.2 当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数报告菌数；当有2个或2个以上稀释剂的菌落数符合上述规定，以最高的平均菌落数乘以稀释倍数值的值报告。 10.1.6.3 如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均茵落数小于1时，以小于1乘以最低稀释倍数报告菌数。 菌数报告规则示例见下表2。 表2 菌数报告规则示例 菌数报告 规则示例 各稀释级（供试液1ml皿）平均菌落计数（cfu） 菌数报告数 （cfug

25、，ml，10cm2） 原液 1:10（1） 1:102（2） 1:103（3） 1 64 8 2 640 2 420 64 8 6400 3 不可计 420 64 64000 4 0 0.5 0 100 5 0 0 100 6 0 0 0 10 7 0 0 0 1六 微生物限度标准 非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及中药的特殊性而制订的。药品的生产、贮存、销售过程中的检验，中药提取物及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。 1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂 应符合无

26、菌检查法规定。 2.口服给药制剂 2.1 不含药材原粉的制剂 细菌数 每1g 不得过1000cfu。每1ml 不得过100cfu。霉菌和酵母菌数 每1g 或1ml 不得过100cfu。大肠埃希菌 每1g 或1ml 不得检出。2.2 含药材原粉的制剂细菌数 每1g 不得过10 000cfu（丸剂每1g 不得过30 000cfu）。每1ml不得过500cfu。霉菌和酵母菌数 每1g 或1ml 不得过100cfu。大肠埃希菌 每1g 或1ml 不得检出。大肠菌群 每1g 应小于100 个。每1ml 应小于10 个。2.3 含豆豉、神曲等发酵原粉的制剂细菌数 每1g 不得过100000cfu。每1ml 不得过1000cfu。霉菌和酵母菌数 每1g 不得过500cfu。每1ml