皱褶假丝酵母脂肪酶

1、皱褶假丝酵母脂肪酶的固定化方法比较研究姓名：崔莹莹 专业：生物工程学号：201102010129 指导老师：李 璟背景 脂肪酶作为最主要的工业酶制剂之一，能够催化油脂类分解、交换、合成等酶促反应，脂肪酶的固定化技术，不仅能够实现重复利用和自动化生产，亦可以大大提高酶的贮存稳定性，使成本下降，在食品工业、纤维及造纸工业、生物能源、制药工业、生物感应器工业等领域的应用前景非常广泛。目的和意义 但目前我国脂肪酶的研发及产业化水平与国外存在较大差距，而且对于脂肪酶的固定化方法没有进行过系统的比较研究。 本研究采用不同方法固定化相同质量的皱褶假丝酵母脂肪酶，通过测定游离脂肪酶及固定化酶的循环水解酶活得到

2、固定化酶对比游离酶的优势，并比较不同固定化酶方法的优劣，为今后深入对微生物脂肪酶固定化的研究提供参考依据。实验流程 1.使用不同方法固定化相同质量的皱褶假丝酵母脂肪酶 2.采用橄榄油乳化法测定游离酶与固定酶的循环水解酶活3.通过循环水解酶活的变化比较不同固定化酶方法的优劣实验步骤1.海藻酸钠包埋法制备固定化酶I.酶液的配制：称取脂肪酶200mg，用pH为5.8的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液，稀释至40mL，即配制成浓度为5g/L的酶液。II.固定化方法：将0.60g海藻酸钠放入50mL烧杯中，加入20mL蒸馏水，35水浴加热溶解，待溶液冷却后，混合海藻酸钠溶液与酶液，用针形注射器滴入

3、凝结剂（1% CaCl2）溶液中，35恒温固定化1h，便制得固定化脂肪酶，过滤，用无菌蒸馏水淋洗4次，室温干燥。实验结果1.海藻酸钠包埋法制备固定化酶这种固定化酶为球状固体，颜色乳白接近透明，循环使用时只需倒掉反应液就可以直接取出固定化酶，操作简单。实验步骤2.壳聚糖戊二醛交联法制备固定化酶I.壳聚糖颗粒的制备：取1.00g的壳聚糖溶于30mL1%的乙酸溶液中，35水浴加热使其充分溶解形成胶状溶液，用注射器滴入凝结剂(1mol/L的NaOH溶液)中形成球状颗粒，便制得壳聚糖颗粒。水洗至中性，室温干燥。II.酶液的配置：200mg脂肪酶溶于40ml的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)中，制

4、得5g/L的酶液；III.固定化方法：取壳聚糖颗粒0.40g，加入0.05%戊二醛5mL交联1h，用无菌蒸馏水淋洗载体，放入酶液，35恒温固定化1h，过滤，用无菌蒸馏水淋洗4次，室温干燥，便制得固定化脂肪酶。实验结果2.壳聚糖戊二醛交联法制备固定化酶这种固定化酶为黄色固体颗粒，循环使用时只需倒掉反应液就可以直接取出固定化酶，操作简单。实验步骤3.硅藻土吸附法制备固定化酶I.酶液的制备：将200mg酶粉溶解于40mL的0.025mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)中，便制得浓度为5g/L的酶液。II.固定化酶的制备：将1.00g的硅藻土加入酶液中，35恒温固定化1h后，将固定化载体用丙酮淋洗4次，

5、每次淋洗后4000r/min离心收集固体，使载体颗粒分散，室温干燥。实验结果3.硅藻土吸附法制备固定化酶这种固定化酶为白色粉末状固体，循环使用时可以用过滤、离心等方法取出固体的固定化酶，操作比较简单。实验步骤橄榄油乳化法是使用最普遍的测定酶活方法，本实验采取此方法测定酶活性及酶活回收率。酶活计算公式：U=(V-V)nkm/tU样品的酶活力；V滴定样品时消耗NaOH 标准溶液的体积/ml；V滴定对照组时消耗NaOH标准溶液的体积/ml；n酶液的稀释倍数；k指1mL碱中所含有的OH的微摩尔数；m固定化初始加入微生物脂肪酶的质量；t反应时间/min。实验步骤4.游离酶的循环转脂酶活测定：取两个三角瓶

6、，分别加入橄榄油乳化液5mL，pH缓冲液（0.05mol/L 甘氨酸NaOH缓冲液）4mL，35水浴加热5min（预热）后，取其中一个三角瓶加入200mg酶粉，反应10min，加入15mL 95%乙醇中止反应。另一个三角瓶先加15mL95%乙醇后再加200mg酶粉；两个三角瓶各加入2滴酚酞溶液作指示剂，用NaOH溶液滴定，直至反应液微红色并保持30s不退色为终点。用pH计测定此时溶液的pH值，对照组滴定终点便是此pH（9.0）。记录消耗NaOH溶液的体积。实验步骤4.游离酶的循环转脂酶活测定：将所有反应液倒入50ml离心管，4000r/min离心10min，倒出上清液将沉淀用无菌蒸馏水淋洗2次

7、（每次洗涤过后都要再4000r/min离心10min），然后将沉淀（游离酶）加入另一个含新鲜乳化液的三角瓶中，反应10min，测定水解酶活。上述操作重复10次，计算游离酶的酶活回收率。实验结果4.游离酶的循环转脂酶活测定结果：如图所示，游离酶在循环利用8次后，酶活由初始的80.4U/mg变为33.0U/mg，反应至第10次的酶活更是降至13.2U/mg。实验步骤5.固定化酶的循环水解酶活测定：实验共制得三种固定化酶，按照游离酶循环水解酶活的测定方法分别滴定三种固定化酶，记录消耗的NaOH溶液的体积，并计算固定化酶的水解酶活。注意将固定化酶全部取出，即固定化酶含有脂肪酶的质量为200mg。重复操

8、作，直至酶活明显降低，计算固定化酶的酶活回收率。实验结果5.固定化酶的循环水解酶活测定结果：如图所示，海藻酸钠包埋法制取的固定化酶在循环利用第14次后，酶活由初始的78.0U/mg变为66.0U/mg，反应至第16次后残余酶活还有33.6U/mg；壳聚糖戊二醛交联法制取的固定化酶在循环利用第17次后，酶活由初始的75.6U/mg变为63.6U/mg，反应至第19次后残余酶活还有45.0U/mg；硅藻土吸附法制取的固定化酶在循环利用第10次后，酶活由初始的57.0U/mg变为45.6U/mg，反应至第16次后残余酶活还有25.2U/mg。实验结果 6.游离与固定化脂肪酶循环水解酶活的比较游离酶初始酶活最高，海藻酸钠包埋法和壳聚糖戊二醛交联法制备的固定化酶次之，硅藻土吸附法固定化的脂肪酶酶活最低；游离酶循环水解酶活下降迅速，在反应至第5次时就开始出现下降趋势，而海藻酸钠包埋法和壳聚糖戊二醛交联法和硅藻土吸附法制备的固定化酶出现下降趋势分别是在第14次、第17次和第10次。结论1.脂肪酶的固定化操作过程会造成酶活性的损失。2.通过实验发现使用海藻酸钠包埋法和壳聚糖戊二醛交联法制备的固定化酶的水解酶活相对硅藻土吸附法较高，分别为78.0U/mg和75.6U/mg。3.使用壳聚糖戊二醛交联法制备的固定化酶的重复使用率最高，