蛋白质纯化及常用设备简介

1、汇报人：李保健 牛莹莹1蛋白质纯化原则2蛋白质纯化的前处理3蛋白质纯化的粗分离4蛋白质纯化的细分离5纯化过程的注意事项CONTENTS目录蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。(一)材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。机械破碎法机械破碎法渗

2、透破碎法渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。反复冻融法反复冻融法酶法酶法超声波法超声波法自溶法自溶法表面活性剂处表面活性剂处理法理法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。如用溶菌酶破坏微生物细胞。利用组织细胞和微生物的自身酶系，在一定的pH值和温度下，使细胞裂解在适当的温度、pH值和低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使细胞膜通透性改变而导致细胞溶解破碎组

3、织细胞的常用方法破碎组织细胞的常用方法反复冻融法： 将待破碎的细胞置-20冰箱内完全冻结，然后在室温融化，如此反复2-3次，大部分组织细胞及细胞内颗粒可被融破，此法主要适用于对组织细胞的处理。如果要提取细菌或病毒中的蛋白或核酸，可用类似的冷热交替法，先将细胞置于沸水浴中，90左右维持数分钟，然后立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破碎。超声破碎法： 利用超声波的机械振动使流体形成局部减压发生内部流动、漩涡生成和消失，产生足以使细胞破碎的压力。超声波所使用的频率为1-20kHz不等。一次超声处理1-2分钟，总时间为10-15分钟。 优点:超声破碎法操作简单、省时且作用较温和，一般组织细胞皆

4、易破碎，而细菌，尤其是真菌的厚膜孢子则较难打破。超声破碎时需间歇进行，以避免长时间产热使抗原破坏自溶法： 利用组织细胞和微生物的自身酶系，在一定的pH值和温度下，使细胞裂解。动物组织细胞自溶的温度常选用0-4，对微生物常选用室温。自溶时需加入少量防腐剂，如甲苯、氯仿等叠氮钠能抑制美的活力，不宜使用。酶处理法： 溶菌酶在碱性条件下，能溶解革兰阳性菌的细胞壁，有EDTA存在时，溶菌酶也能溶解某些革兰氏阴性菌的细胞壁；纤维素酶主要溶解真菌细胞壁；蜗牛酶能溶解酵母菌细胞壁和植物细胞壁。优点：酶处理法具有作用条件温和，内含物成分不易受破坏，细胞壁损坏程度可以控制等特点表面活性剂处理法： 在适当的温度、p

5、H值和低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使细胞膜通透性改变而导致细胞溶解。常用的表面活性剂有SDS、去氧胆酸钠、二乙基十六烷基溴、吐温、Triton-100等。本法作用较温和，多用于细菌的破碎组织捣碎机：使用时，将材料配成稀组织捣碎机：使用时，将材料配成稀糊状液，放置于筒内约糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。一般开关后，逐步加速至所需速度。一般用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽等，转速可高达的叶芽等，转速可高达10000rpm/M以以上。由

6、于旋转刀片的机械切力很大上。由于旋转刀片的机械切力很大,制制备一些较大分子如核酸则很少使用备一些较大分子如核酸则很少使用。组织匀浆机：使用时将材料剪成小组织匀浆机：使用时将材料剪成小块或颗粒状加入适量缓冲液，放置块或颗粒状加入适量缓冲液，放置于匀浆机下玻璃杯内不超过于匀浆机下玻璃杯内不超过2 /3体体积，固定好将刀头伸入液面之下，积，固定好将刀头伸入液面之下，逐步加速至所需速度，使用用时应逐步加速至所需速度，使用用时应间接使用时间以连续间接使用时间以连续3分钟为限，分钟为限，连续工作连续工作3分钟后，停止分钟后，停止5分钟后方分钟后方可使用。可使用。蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋

7、白质与其它杂蛋白分离开来。 比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。蛋白质粗制品的获得常用方法透析萃取盐析法等电点沉淀法离心有机溶剂沉淀法 离心： 是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。分为差速离心法和密度梯度离心法1. 差速沉降离心法： 这是最普通的离心法。即采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。 差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时，

8、在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此法所得的沉淀是不均一的，仍杂有其它成分，需经过23次的再悬浮和再离心，才能得到较纯的颗粒。 此法主要由于组织匀浆液中分离细胞器和病毒，其优点是：操作简易，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：须多次离心，沉淀中有夹带，分离效果差，不能一次得到纯颗粒，沉淀于管底的颗粒受挤压，容易变性失活2. 密度梯度区带离心法（简称区带离心法）： 区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进

9、行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法的优点是：分离效果好，可一次获得较纯颗粒；适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 此法的缺点是：离心时间较长；需要制备惰性梯度介质溶液；操作严格，不易掌握。 离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉

10、降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1.28 kg/cm3和60。 此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间 。透析法： 是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。例如分离和纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等物质时，可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。反之也可将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而加以分离精制透析是否成功与透析膜的规格关系极大。透析膜的膜孔有大有小，要根据欲分离成分的具体情况而选择。透

11、析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜（硫酸纸膜）、蛋白质胶膜、玻璃纸膜等。常多用市售的玻璃纸或动物性半透膜扎成袋状，外面用尼龙网袋加以保护，小心加入欲透析的样品溶液，悬挂在清水容器中。经常更换清水使透析膜内外溶液的浓度差加大，必要时适当加热，并加以搅拌，以利透析速度加快。为了加快透析速度，还可应用电透析法，即在半在半透膜旁边纯溶剂两端放置二个电极，接通电路，则透析膜中的带有正电荷的成分如无机阳离子、生物碱等向阴极移动，而带负电共荷的成分如无机阴离子、有机酸等则向阳极移动，中性化合物及高分子化合物则留在透析膜中。透析是否完全，须取透析膜内溶液进行定性反应检查。萃取：萃取，又称溶剂萃取或液液萃取，亦

12、称抽提，是利用系统中组分在溶剂中有不同的溶解度来分离混合物的单元操作。即，是利用物质在两种互不相溶（或微溶）的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使溶质物质从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中的方法。是分离和提纯有机化合物常用的一种方法,而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质。双水相萃取技术：是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相,由于被分离物在两相中分配的不同,便可实现分离,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高。对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩

13、,细胞碎片等固体物分布在下相中。采用双水相系统浓缩目的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响反胶团萃取法：是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。反胶团是当表面活性剂在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体。这种方法的优点是萃取过程中蛋白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护。盐析法 向某些蛋白质溶液中加入某些无机盐溶液后，可以降低蛋白质的溶解度，使蛋白质凝聚而从溶液中析出,这种作用叫作盐析，是物理变化，可复原。向某些蛋白质溶液中加入某些重金属盐，可以使蛋白质性质发生改变而凝聚，进而从溶液中析出，这种作用叫作变性，性质改变，是化学反应

14、，无法复原。 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 机理：通过破坏蛋白质分子表面水膜或中和蛋白质分子表面水膜使蛋白质凝聚沉淀。盐析用中性盐的选择 （1）常用的中性盐常用的中性盐有MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4、NaH2PO4。 （2）选择中性盐应注意的问题使酶沉淀完全、收率高；且有利于酶的提纯，而本身又易去除。对酶无毒性，应用不受影响。价格低廉。废水处理容易。 盐析法的优点成本低，不需要什么特别昂贵的设备；操作简单，安全；对许多生物活性物质具有稳定作用。盐析法的缺点沉淀物中含有大

15、量的盐析剂。 有机溶剂沉淀法 有机溶剂的沉淀作用主要是降低水溶液的介电常数，溶液的介电常数减少就意味着溶质分子异性电荷库仑引力的增加从而使溶解度减少。机理:中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。有机溶剂的选择有机溶剂沉淀蛋白质的能力随蛋白质种类及有机溶剂的种类而异。对曲霉淀粉酶而言，有机溶剂沉淀能力，依次为丙酮异丙醇乙醇甲醇。这个顺序还受温度、

16、pH、盐离子浓度的影响。丙酮沉淀能力最强，但挥发损失多，价格相对较高，工业上一般采用乙醇。 有机溶剂优点分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只有在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。沉淀不用脱盐，过滤比较容易。在生化制备中应用比盐析法广泛。有机溶剂缺点容易引起蛋白质变性失活，操作常需在低温下进行。且有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。 等电点沉淀法： 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。机理：等电点沉淀法主要利用两性分子上的电中性时溶解度最低，而各种两性分子具有不同等电点而进行分离的一种方法。两性分子在处于等电点时的pH值，再加上其他沉淀因素，则很易沉淀析出。 等电点沉

17、淀法的优点 很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价较廉，井且某些酸，如磷酸、盐酸和硫酸的应用能为蛋白质类食品所允许。同时，常可直接进行其他纯化操作，无需将残余的酸除去。等电点沉淀法的缺点 酸化时，易使蛋白质失活，这是由于蛋白质对低pH比较敏感。 蛋白质细制品的获得常用方法结晶结晶亲和层析亲和层析凝胶过滤凝胶过滤离子交换层析离子交换层析吸附层析吸附层析蛋白电泳蛋白电泳色谱色谱凝胶过滤层析 凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，使蛋白质混合

18、物中的物质按分子大小的不同进行分离。也叫做分子排阻层析。缓冲液缓冲液大分子不能进入凝胶颗粒内部，直大分子不能进入凝胶颗粒内部，直接沿凝胶颗粒间隙流出，流程短，接沿凝胶颗粒间隙流出，流程短，故先洗脱出来故先洗脱出来;小分子则扩散进入凝胶微孔，流程小分子则扩散进入凝胶微孔，流程长，在柱内保留时间长，则后洗脱长，在柱内保留时间长，则后洗脱出来出来G-25凝胶颗粒凝胶颗粒大分子大分子小分子小分子机理机理:凝胶过滤法的分子筛效应凝胶过滤法的分子筛效应样本样本大分子大分子小分子小分子凝胶颗粒凝胶颗粒凝胶柱的使用及层析过程凝胶的选择：根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小

19、分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用SephadexG-25和G-50。 柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。加样和洗脱凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。 凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。凝胶过滤层析的优点 它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，

20、不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶过滤层析的缺点 从凝胶过滤的原理可知，蛋白质分子通过凝胶柱的速度(即洗脱体积的大小)并不直接取决于分子的质量，而是它的斯笃克半径，利用凝胶过滤法测定蛋白质分子量时，标准蛋白质(已知分子量和斯笃克半径)和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体)，否则不能得到比较准确的分子量。分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质，则不能用此方法测定分子量。而且柱子成本比较高，整个实验过程耗时很长。色谱： 又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附

21、、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。离子交换层析 离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法机理：离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂;而带有负电荷的称之阳离子树脂。由于蛋白质有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳

22、离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。离子交换层析缺点 1、会产生过量的再生废液; 2、周期较长; 3、耗盐量大; 4、有机物的存在会污染离子交换树脂; 5、排出大量含盐废水易引起管道腐蚀。 此外，对于溶液中存在多种离子时，需要针对不同的目的离子选用不同的树脂，普遍适用性差。吸附层析 吸附层析又称色层法；是根据各种被分离组分在固定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的的一种纯化方法机理：利用被分离样品中不同组分与吸附剂之间的吸附能力的差异进行分离。吸附力大的组分在柱子上保留时间长吸附力小的组分很快被洗脱，混合物在层析柱中分

23、离的过程实质上是吸附与解吸附的过程吸附层析的优点 分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高、样品用量少、易于自动化等优点吸附层析的缺点 定性能力差亲和层析 利用共价连接有特异配体的层析介质，分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白质或其他分子的层析技术机理：将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。 利用共价连接有特异配体的

24、层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其它分子的层析技术。亲和层析的优点 亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱过程简单、快速，是一种理想的有效分离纯化生物大分子的手段。亲和层析具有高选择性高活性回收率和高纯度等特点。亲和层析的优点 载体 价格昂贵机械强度低配基的制备困难偶联条件激烈需要使用剧毒的活化剂 等高效液相色谱仪： 高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附

25、-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。高效液相色谱法只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制，流动相可选择的范围宽，固定相的种类繁多，因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。 电泳：是指带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。电泳种类移动界面是将被分离的离子（如阴离子）混合物置于电泳槽的一端（如负极），在电泳开始前，样品与载体电解质有清晰的界面。电泳开始后，带电粒子向另一极（正极）移动，泳动速度最快的离子走在最前面，其他离子依电极速度快慢顺序排列，形成不同的区带。只有第一个区带的界面是清晰的，达到完全分离，其中含有电泳速度最快的离子，其他大部分区带重叠。区带电泳是在一定的支持物上，于均一的载体电解质中，将样品加在中部位置，在电场作用下，样品中带正或负电荷的离子分别向负或正极以不同速度移动，分离成一个个彼此隔开的区带。区带电泳按支持物的物理性状不同，又可分为纸和其他纤维膜电泳、粉末电泳、凝胶电泳与丝线电泳。等电聚焦是将两性电解质