第四章 细胞分化与器官培养

1、第一节 细胞分化和器官培养第二节 器官培养第三节 胚胎培养第一节 细胞分化和器官分化一、植物细胞的全能性的提出与论证一、植物细胞的全能性的提出与论证19021902年年: :德国植物学家德国植物学家 HaberlandtHaberlandt 在自然固有的植物再生在自然固有的植物再生现象现象-有性繁殖和无性繁殖的启迪下大胆提出：高等植物有性繁殖和无性繁殖的启迪下大胆提出：高等植物的器官和组织可以不断分裂至单个细胞，并预言的器官和组织可以不断分裂至单个细胞，并预言“植物体细植物体细胞在一定条件下可以如同受精卵一样，具有潜在发育成植株胞在一定条件下可以如同受精卵一样，具有潜在发育成植株的能力的能力”

2、。19581958年年：Steward Steward 等通过胡萝卜根韧皮部细胞振荡悬浮培养等通过胡萝卜根韧皮部细胞振荡悬浮培养获得完整小植株，并开花结实，首次体外证明植物细胞具有获得完整小植株，并开花结实，首次体外证明植物细胞具有发育成植株的现在能力，即发育成植株的现在能力，即“细胞全能性细胞全能性”。19641964年年：印度德里大学：印度德里大学 Guba Guba 等培养毛叶曼陀罗花药获得由等培养毛叶曼陀罗花药获得由小孢子发育而成的小植株，继而证明生殖细胞在离体条件下小孢子发育而成的小植株，继而证明生殖细胞在离体条件下也具有发育成完整植株的潜在能力。也具有发育成完整植株的潜在能力。（一

3、）植物细胞全能性的定义植物细胞全能性植物细胞全能性 ( ( totipotancytotipotancy ) ) 是指植物的细胞具是指植物的细胞具有发育为胚胎和植株的潜能，即植物细胞具有该植物有发育为胚胎和植株的潜能，即植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。植物体的潜在能力。两两层含义：层含义：（1 1）植物细胞（体细胞或生殖细胞）均具有该物种全）植物细胞（体细胞或生殖细胞）均具有该物种全部的遗传信息。部的遗传信息。（2 2）每个植物细胞均具有发育成完整植物体的潜在能）每个植物细胞均具有发育成完整植物体的

4、潜在能力。力。（二）植物细胞全能性的实现途径（1 1）以植物的）以植物的体细胞体细胞（如根、茎、叶、花、果、木质部、（如根、茎、叶、花、果、木质部、形成层、韧皮部、中柱鞘等）为培养材料，诱导形成完整植形成层、韧皮部、中柱鞘等）为培养材料，诱导形成完整植物体。该植物体为两套染色体组，可正常开花结实。物体。该植物体为两套染色体组，可正常开花结实。（2 2）以植物的）以植物的生殖细胞生殖细胞（如小孢子和大孢子细胞）为培养（如小孢子和大孢子细胞）为培养材料，诱导形成完整小植物体。该植物体为单套染色体组，材料，诱导形成完整小植物体。该植物体为单套染色体组，不能正常开花结实。不能正常开花结实。（3 3）培

5、养去壁的）培养去壁的原生质体原生质体，使原生质体发育成植物体。，使原生质体发育成植物体。（4 4）利用诱导剂，促使两个不同种的）利用诱导剂，促使两个不同种的原生质体相互融合原生质体相互融合后后进行培养，使之发育为杂种植物体。进行培养，使之发育为杂种植物体。（5 5）将遗传信息（基因）利用不同基因载体导入植物细胞，）将遗传信息（基因）利用不同基因载体导入植物细胞，通过离体培养使之再生成具有新形状的植物体通过离体培养使之再生成具有新形状的植物体转基因植转基因植物。物。二、细胞分化二、细胞分化定义定义：细胞分化（：细胞分化（cell differentiationcell differentiati

6、on）是指同一）是指同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程，其结果是在空间上细胞产生差异，的细胞类群的过程，其结果是在空间上细胞产生差异，在时间上同在时间上同一细胞一细胞与其从前的状态有所不同与其从前的状态有所不同。实质实质：基因的差别表达（：基因的差别表达（differential expressiondifferential expression）成因成因：细胞内部特性：与细胞的不对称分裂及随机：细胞内部特性：与细胞的不对称分裂及随机状态有关。状态有关。 外部环境：表现为细胞对不同环境信号的应外部环境：表现为细胞对不

7、同环境信号的应答，启动相关基因，产生不同的细胞行为，如分裂、答，启动相关基因，产生不同的细胞行为，如分裂、生长、凋亡等。生长、凋亡等。自然状态自然状态：胚胎细胞随着分化发育的进程，从全能性：胚胎细胞随着分化发育的进程，从全能性到多能性，再到单能性，最后失去分化潜能成为成熟到多能性，再到单能性，最后失去分化潜能成为成熟定型的细胞，丧失分化潜能。正常的自然状态下，细定型的细胞，丧失分化潜能。正常的自然状态下，细胞分化是稳定、不可逆的。胞分化是稳定、不可逆的。脱分化脱分化：当失去分化能力的细胞回复到分生状态并进：当失去分化能力的细胞回复到分生状态并进行分裂，形成无分化的细胞团即愈伤组织的过程。行分裂

8、，形成无分化的细胞团即愈伤组织的过程。再分化再分化：由无分化的愈伤组织细胞再转变为具有一定：由无分化的愈伤组织细胞再转变为具有一定结构，执行一定生理功能的细胞团和组织，构成一个结构，执行一定生理功能的细胞团和组织，构成一个完整植物体或植物器官的过程。完整植物体或植物器官的过程。植物组织培养三、器官分化三、器官分化（一）植物器官分化的概念和途径（一）植物器官分化的概念和途径植物器官分化植物器官分化（器官发生）是指离体植物组织或细胞（器官发生）是指离体植物组织或细胞在组织培养的条件下形成无根苗、根和花芽等器官的在组织培养的条件下形成无根苗、根和花芽等器官的过程。过程。实现途径实现途径：器官分化途径

9、，即由愈伤组织的部分：器官分化途径，即由愈伤组织的部分细胞先分化产生芽，再在另一种培养基上产生根或芽，细胞先分化产生芽，再在另一种培养基上产生根或芽，继而形成一个完整的植株。继而形成一个完整的植株。 胚状体发生途径，愈伤组织中产生出类胚状体发生途径，愈伤组织中产生出类似种子胚的两极性结构，然后再在另一种培养基上同似种子胚的两极性结构，然后再在另一种培养基上同时发展成带根苗。时发展成带根苗。（二）植物器官分化的主要影响因素（二）植物器官分化的主要影响因素基因型：不同品系的成熟胚在诱导率、再生率和组基因型：不同品系的成熟胚在诱导率、再生率和组培苗在形态上存在明显差异。培苗在形态上存在明显差异。培养

10、基成分：器官发生的不同时期对培养基的要求培养基成分：器官发生的不同时期对培养基的要求是有差异的。是有差异的。pHpH温度温度空气空气无菌环境无菌环境适时光照适时光照（三）植物再生的生理生化基础（三）植物再生的生理生化基础植物通过器官分化途径再生植株的过程也是外植体内植物通过器官分化途径再生植株的过程也是外植体内部产生生理生化变化的过程。因此，了解再生植株过部产生生理生化变化的过程。因此，了解再生植株过程中外植体内部发生的程中外植体内部发生的DNADNA、RNARNA和蛋白质的合成、氮和蛋白质的合成、氮同化和氨基酸代谢、碳水化合物的代谢与利用、内源同化和氨基酸代谢、碳水化合物的代谢与利用、内源激

11、素的平衡等生理生化变化规律，有助于认识植物再激素的平衡等生理生化变化规律，有助于认识植物再生的本质。生的本质。第二节 器官培养 器官培养器官培养（Organ cultureOrgan culture）是指将植株上的各种器官）是指将植株上的各种器官（即植物根、茎、叶、花、果实、芽原基（即植物根、茎、叶、花、果实、芽原基和根原基和根原基等）从等）从母体上分离出来，放在无菌的人工环境中让其进一步发育，母体上分离出来，放在无菌的人工环境中让其进一步发育，最终长成幼苗的过程。最终长成幼苗的过程。 器官培养的优点器官培养的优点：相对于细胞或组织培养而言，植物相对于细胞或组织培养而言，植物器官培养适用的植物

12、种类最多，应用范围最广，不仅为植器官培养适用的植物种类最多，应用范围最广，不仅为植物生理生化等研究提供了最好的材料与方法，也具有重要物生理生化等研究提供了最好的材料与方法，也具有重要的生产实践价值。的生产实践价值。植物器官培养的实际应用：植物器官培养的实际应用：利用茎、叶、花器等培养进行快速繁殖利用茎、叶、花器等培养进行快速繁殖利用茎尖进行脱毒培养，解决品种的退化问题，提利用茎尖进行脱毒培养，解决品种的退化问题，提高产量和质量高产量和质量将植物器官做诱变处理，得到突变株，进行细胞突将植物器官做诱变处理，得到突变株，进行细胞突变育种变育种利用高度分化的茎、芽进行培养，获得高含量此生利用高度分化的

13、茎、芽进行培养，获得高含量此生代谢的研究等。代谢的研究等。一、器官培养的过程一、器官培养的过程1.1.培养材料的采集：培养材料的采集：快速繁殖采用快速繁殖采用5mm5mm左右的茎尖；脱左右的茎尖；脱毒培养仅取茎尖长度毒培养仅取茎尖长度0.1mm0.1mm以下的分生组织部分。以下的分生组织部分。2.2.培养材料的消毒：培养材料的消毒： （1 1）流动自来水清洗）流动自来水清洗 蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗 无菌无菌纱布或吸水纸吸干纱布或吸水纸吸干 消毒刀切成小块消毒刀切成小块 （2 2）在无菌环境中将材料放入）在无菌环境中将材料放入70%70%乙醇中浸泡乙醇中浸泡30-30-60s60s后，用无菌水冲洗

14、后，用无菌水冲洗2-32-3次。次。 （3 3）将材料移入漂白粉饱和液或）将材料移入漂白粉饱和液或0.1%0.1%升汞溶液中消升汞溶液中消毒毒6-12min6-12min。 （4 4）取出后用无菌水冲洗）取出后用无菌水冲洗3-63-6次。次。3.3.制备外植体：制备外植体：在无菌环境中，用已消毒的刀、剪、在无菌环境中，用已消毒的刀、剪、镊等剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮或种皮胚乳，然后切镊等剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮或种皮胚乳，然后切成成0.2-0.5cm0.2-0.5cm厚的小片。厚的小片。4.4.接种和培养：接种和培养：在无菌环境下，将外植体接种在适宜在无菌环境下，将外植体接种在适宜培养基上，封口

15、培养。待新芽等形成后继代培养或把培养基上，封口培养。待新芽等形成后继代培养或把材料分株、切段转入增殖或分化培养基中继续培养。材料分株、切段转入增殖或分化培养基中继续培养。5.5.根的诱导：根的诱导：继代培养形成的不定芽或侧芽一般没有继代培养形成的不定芽或侧芽一般没有根，必须转到相应的生根培养基上进行培养，大约根，必须转到相应的生根培养基上进行培养，大约1 1个个月后即可获得健壮根系。月后即可获得健壮根系。6.6.炼苗与移栽：炼苗与移栽：室内自然光照室内自然光照3 3天天自来水洗净根部自来水洗净根部培养基培养基移栽适宜的基质中移栽适宜的基质中第三节 胚胎培养（一）胚胎培养的内容（一）胚胎培养的内

16、容胚胎培养（胚胎培养（embryo cultureembryo culture）：）：是是指对植物的胚（成指对植物的胚（成熟胚、幼胚）及胚器官（如子房、胚珠、胚乳）进行熟胚、幼胚）及胚器官（如子房、胚珠、胚乳）进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术。广义的人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术。广义的胚胎培养研究还包括试管受精等技术。胚胎培养研究还包括试管受精等技术。（二）植物胚胎培养的意义（二）植物胚胎培养的意义1.1.克服杂种胚的败育，获得稀有植物克服杂种胚的败育，获得稀有植物2.2.获得单倍体和多倍体植株获得单倍体和多倍体植株3.3.打破种子休眠，促进胚萌发打破种子休眠，促进胚萌发4

17、.4.快速繁殖良种，缩短育种周期快速繁殖良种，缩短育种周期5.5.克服种子生活力低下和自然不育性，提高种子发芽克服种子生活力低下和自然不育性，提高种子发芽率率6.6.提高后代抗性，改良品质提高后代抗性，改良品质7.7.种子活力的快速测定种子活力的快速测定8.8.种植资源的搜集和保存种植资源的搜集和保存9.9.用于理论研究用于理论研究（三）胚培养的方法（三）胚培养的方法成熟胚培养方法成熟胚培养方法幼胚培养方法幼胚培养方法胚乳培养方法胚乳培养方法胚珠培养方法胚珠培养方法子房培养方法子房培养方法胚的发育过程胚的发育过程(A) (A) 成熟胚培养的方法成熟胚培养的方法1.1.成熟胚培养成熟胚培养 在在

18、无菌的条件下，采用人工的方法将成熟胚分离无菌的条件下，采用人工的方法将成熟胚分离出来，进行培养，让其进一步生长发育，以至形成幼出来，进行培养，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。苗的过程。2.2.成熟胚培养的目的成熟胚培养的目的（1 1）研究种子萌发时胚乳与胚的关系）研究种子萌发时胚乳与胚的关系（2 2）胚乳对幼苗初期生长的营养作用）胚乳对幼苗初期生长的营养作用（3 3）研究成熟胚生长发育过程的形态建成）研究成熟胚生长发育过程的形态建成（4 4）各种生长物质对形态建成的影响）各种生长物质对形态建成的影响（5 5）打破种子休眠，缩短育种周期）打破种子休眠，缩短育种周期3.3.成熟胚培养的程序

19、成熟胚培养的程序（1 1）选果实或种子作为外植体）选果实或种子作为外植体（2 2）表面消毒）表面消毒（3 3）无菌条件下切开果实，取出种子）无菌条件下切开果实，取出种子（4 4）胚的剥离）胚的剥离（5 5）培养基培养：）培养基培养：MSMS、WhiteWhite培养基培养基4.4.成熟胚培养条件成熟胚培养条件 （1 1）因成熟胚本身含有较多的营养条件，对培养基要）因成熟胚本身含有较多的营养条件，对培养基要求不高求不高 （2 2）只含有大量元素和糖的培养基上，便可萌发成苗）只含有大量元素和糖的培养基上，便可萌发成苗 （3 3）多数植物成熟胚的生长以）多数植物成熟胚的生长以12h/12h/天光照为

20、宜。天光照为宜。（B B）幼胚培养方法）幼胚培养方法幼胚培养：在无菌的条件下，将未成熟胚分离出来，幼胚培养：在无菌的条件下，将未成熟胚分离出来，进行培养发育，以至形成幼苗的过程进行培养发育，以至形成幼苗的过程。1.1.幼胚培养过程幼胚培养过程 （1 1）取）取子房子房 （2 2）常规）常规表面消毒表面消毒 （3 3）解剖）解剖镜下，取胚珠、去珠被、取出完整幼胚。镜下，取胚珠、去珠被、取出完整幼胚。 （4 4）固体培养基）固体培养基培养培养 植物胚胎发生过程植物胚胎发生过程 原胚原胚球形胚心型胚鱼雷胚子叶胚球形胚心型胚鱼雷胚子叶胚2.2.影响胚培养的因素影响胚培养的因素（1 1）培养基：）培养基

21、： 无机盐：无机盐：幼胚培养有幼胚培养有MSMS、B5B5等培养基，可使等培养基，可使K K+ +、CaCa2 2+ + 水平水平稍高稍高。 碳水化合物：碳水化合物：调节渗透压；碳源；防止幼胚早萌。调节渗透压；碳源；防止幼胚早萌。 植物激素：植物激素：成熟胚一般不需要外源激素即可萌发。成熟胚一般不需要外源激素即可萌发。但但 激素激素能促进休眠胚的萌发能促进休眠胚的萌发。幼。幼胚需要外源激素，应保持外胚需要外源激素，应保持外源激素与内源激素的平衡。过低则不能促进生长，过高则源激素与内源激素的平衡。过低则不能促进生长，过高则易导致幼胚脱分化形成愈伤易导致幼胚脱分化形成愈伤。 天然提取物及某些蛋白制

22、品：如天然提取物及某些蛋白制品：如大麦大麦胚乳、麦芽提取胚乳、麦芽提取物、酵母提取物、水解酪蛋白等都能促进幼胚的发育。物、酵母提取物、水解酪蛋白等都能促进幼胚的发育。（2 2）环境条件）环境条件 A A、温度：、温度： 多数多数为为25-3025-30，因植物种类有所差别。，因植物种类有所差别。 B B、光照：、光照： 一般一般认为黑暗或弱光条件较为合适认为黑暗或弱光条件较为合适。 3 3. .胚柄胚柄 A A 在幼胚培养中，带有胚柄结构有利于幼胚的生长。在幼胚培养中，带有胚柄结构有利于幼胚的生长。 B B 但一般较难与胚一起分离出来但一般较难与胚一起分离出来。4.4.幼胚的发育方式幼胚的发育

23、方式 （1 1）胚性发育）胚性发育: :幼胚接种培养基幼胚接种培养基, ,发育成成熟胚发育成成熟胚. . （2 2）早熟发育）早熟发育: :幼胚接种培养基幼胚接种培养基, ,不进行胚性发育不进行胚性发育, ,萌发萌发成幼苗成幼苗. . （3 3）产生愈伤组织）产生愈伤组织: :幼胚接种培养基幼胚接种培养基, ,发生细胞增殖发生细胞增殖, ,形形成愈伤组织成愈伤组织. .（C C）胚乳培养）胚乳培养 1 1. .胚乳培养的过程胚乳培养的过程 胚乳外植体制备胚乳外植体制备:种子消毒种子消毒-取出胚乳取出胚乳 培养培养:White或或MS诱导培养基诱导培养基-25-27-暗或弱光暗或弱光 发育发育:

24、诱导形成愈伤组织诱导形成愈伤组织-再分化形成胚状体或再分化形成胚状体或不定不定 芽芽-生根培养生根培养-植株。植株。胚乳培养是指将胚乳从母体上分离出来，在胚乳培养是指将胚乳从母体上分离出来，在无菌的环境条件下培养，使其生长发育形成无菌的环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。幼苗的过程。胚乳培养中应注意的问题胚乳培养中应注意的问题1.1.确定适宜的发育时期确定适宜的发育时期胚乳的发育，大致可以分为早期、旺盛生长期和成熟胚乳的发育，大致可以分为早期、旺盛生长期和成熟期三个阶段。一般情况下处于生长旺盛期的胚乳是最期三个阶段。一般情况下处于生长旺盛期的胚乳是最适合的取材时期，少数取成熟时期的胚乳

25、也能获得成适合的取材时期，少数取成熟时期的胚乳也能获得成功。功。生长旺盛期胚乳的特点：胚已分化完成，胚乳已充分生长旺盛期胚乳的特点：胚已分化完成，胚乳已充分生长，几乎达到成熟时大小；外观为乳白色半透明的生长，几乎达到成熟时大小；外观为乳白色半透明的固体，且富有弹性等特点。固体，且富有弹性等特点。2.2.严格区分胚乳与其他组织严格区分胚乳与其他组织取胚乳接种时，由于胚乳包围着胚，如何绝对地使胚取胚乳接种时，由于胚乳包围着胚，如何绝对地使胚乳与胚分离而不带胚或包裹着胚的珠心、珠被组织，乳与胚分离而不带胚或包裹着胚的珠心、珠被组织，是保证实验正确性的重要环节。否则，在胚乳外植体是保证实验正确性的重要

26、环节。否则，在胚乳外植体中混入二倍体细胞或组织，它们增殖一般又较胚乳快，中混入二倍体细胞或组织，它们增殖一般又较胚乳快，这样不但影响了胚乳的诱导和分化，而且常常会形成这样不但影响了胚乳的诱导和分化，而且常常会形成二倍体愈伤组织与胚乳愈伤组织混杂的局面。二倍体愈伤组织与胚乳愈伤组织混杂的局面。3.3.合理使用植物激素合理使用植物激素植物激素的种类和浓度对胚乳愈伤组织的诱导和器官植物激素的种类和浓度对胚乳愈伤组织的诱导和器官建成起着决定性的作用。在不加任何激素的培养基上，建成起着决定性的作用。在不加任何激素的培养基上，胚乳外植体很少或完全不能启动。不同植物的胚乳培胚乳外植体很少或完全不能启动。不同

27、植物的胚乳培养要求有不同的外源激素及合理的细胞分裂素与生长养要求有不同的外源激素及合理的细胞分裂素与生长素的配比。素的配比。4.4.注意光、温度及注意光、温度及pHpH值的影响值的影响胚乳培养对温度的要求，一般在胚乳培养对温度的要求，一般在24-2824-28之间，在玉米之间，在玉米胚乳培养中，胚乳培养中，2525时是玉米胚乳培养的最适温度，时是玉米胚乳培养的最适温度，3030时，生长比时，生长比2525至少减少了至少减少了50%50%，2020时则下载了时则下载了4 4倍。倍。（D D）胚珠培养）胚珠培养1.1.胚珠培养胚珠培养定义：是指将胚珠从母体上分离出来，在无菌的人工定义：是指将胚珠从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的