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文档简介
1、会计学1实验八亲和层析分离实验八亲和层析分离(fnl)纯化蛋白质纯化蛋白质第一页,共34页。第1页/共34页第二页,共34页。第2页/共34页第三页,共34页。第3页/共34页第四页,共34页。第4页/共34页第五页,共34页。亲和层析原理亲和层析原理(yunl)第5页/共34页第六页,共34页。n用还原型用还原型GSH洗脱洗脱GST融合蛋融合蛋白白第6页/共34页第七页,共34页。第7页/共34页第八页,共34页。GSH- Sepharose 4B第8页/共34页第九页,共34页。第9页/共34页第十页,共34页。第10页/共34页第十一页,共34页。第11页/共34页第十二页,共34页。第
2、12页/共34页第十三页,共34页。第13页/共34页第十四页,共34页。 10.5 mmol/L IPTG诱导大肠杆菌诱导大肠杆菌(d chn n jn)中的蛋白表达,中的蛋白表达,28,200 rpm培养培养3-6 h。25000 rpm离心离心5 min,倒掉上清。,倒掉上清。3沉淀加沉淀加40 ml水,水,5000 rpm离心离心5 min。第14页/共34页第十五页,共34页。第15页/共34页第十六页,共34页。第16页/共34页第十七页,共34页。第17页/共34页第十八页,共34页。重复重复3遍。遍。n4加入加入1ml 洗脱液。洗脱液。第18页/共34页第十九页,共34页。8将
3、读数最大的一管用于将读数最大的一管用于SDS-PAGE分析。分析。第19页/共34页第二十页,共34页。第20页/共34页第二十一页,共34页。第21页/共34页第二十二页,共34页。第22页/共34页第二十三页,共34页。第23页/共34页第二十四页,共34页。在快慢离子间被浓缩。在快慢离子间被浓缩。第24页/共34页第二十五页,共34页。第25页/共34页第二十六页,共34页。试剂名称试剂名称12%分离胶分离胶蒸馏水蒸馏水2.5 ml30% 丙烯酰胺(丙烯酰胺(29:1)3.0 ml1.5M Tris-HCl(pH8.8)2.0 ml10% SDS75 ul四甲基乙二铵(四甲基乙二铵(TE
4、MED)10 ul10% 过硫酸铵(过硫酸铵(AP)75 ul总体积总体积7.5 ml第26页/共34页第二十七页,共34页。第27页/共34页第二十八页,共34页。试剂名称试剂名称5.0%蒸馏水蒸馏水1.7 ml30%丙烯酰胺(丙烯酰胺(29:1)430 ul1M Tris-HCl(pH6.8)310 ul10%SDS25 ul四甲基乙二铵(四甲基乙二铵(TEMED)10 ul10%过硫酸铵(过硫酸铵(AP)25 ul总体积总体积2.5 ml3制作制作5.0%浓缩浓缩(nn su)胶胶 按照下表配好浓缩按照下表配好浓缩(nn su)胶,轻轻混匀胶,轻轻混匀,灌胶,灌胶2ml,插入梳子,聚合,插入梳子,聚合15 min。第28页/共34页第二十九页,共34页。闭电源。闭电源。第29页/共34页第三十页,共34页。第30页/共34页第三十一页,共34页。非诱导非诱导诱导诱导纯化纯化1 纯化纯化2 Marker100KD75KD50KD32KD25KD15KD37,OD=0.8,0.5mmol/L,IPTG,28 ,200rpm,6h第31页/共34页第三十
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