实验八亲和层析分离纯化蛋白质学习教案

1、会计学1实验八亲和层析分离实验八亲和层析分离(fnl)纯化蛋白质纯化蛋白质第一页，共34页。第1页/共34页第二页，共34页。第2页/共34页第三页，共34页。第3页/共34页第四页，共34页。第4页/共34页第五页，共34页。亲和层析原理亲和层析原理(yunl)第5页/共34页第六页，共34页。n用还原型用还原型GSH洗脱洗脱GST融合蛋融合蛋白白第6页/共34页第七页，共34页。第7页/共34页第八页，共34页。GSH- Sepharose 4B第8页/共34页第九页，共34页。第9页/共34页第十页，共34页。第10页/共34页第十一页，共34页。第11页/共34页第十二页，共34页。第

2、12页/共34页第十三页，共34页。第13页/共34页第十四页，共34页。 10.5 mmol/L IPTG诱导大肠杆菌诱导大肠杆菌(d chn n jn)中的蛋白表达，中的蛋白表达，28，200 rpm培养培养3-6 h。25000 rpm离心离心5 min，倒掉上清。，倒掉上清。3沉淀加沉淀加40 ml水，水，5000 rpm离心离心5 min。第14页/共34页第十五页，共34页。第15页/共34页第十六页，共34页。第16页/共34页第十七页，共34页。第17页/共34页第十八页，共34页。重复重复3遍。遍。n4加入加入1ml 洗脱液。洗脱液。第18页/共34页第十九页，共34页。8将

3、读数最大的一管用于将读数最大的一管用于SDS-PAGE分析。分析。第19页/共34页第二十页，共34页。第20页/共34页第二十一页，共34页。第21页/共34页第二十二页，共34页。第22页/共34页第二十三页，共34页。第23页/共34页第二十四页，共34页。在快慢离子间被浓缩。在快慢离子间被浓缩。第24页/共34页第二十五页，共34页。第25页/共34页第二十六页，共34页。试剂名称试剂名称12%分离胶分离胶蒸馏水蒸馏水2.5 ml30% 丙烯酰胺（丙烯酰胺（29:1）3.0 ml1.5M Tris-HCl（pH8.8）2.0 ml10% SDS75 ul四甲基乙二铵（四甲基乙二铵（TE

4、MED）10 ul10% 过硫酸铵（过硫酸铵（AP）75 ul总体积总体积7.5 ml第26页/共34页第二十七页，共34页。第27页/共34页第二十八页，共34页。试剂名称试剂名称5.0%蒸馏水蒸馏水1.7 ml30%丙烯酰胺（丙烯酰胺（29:1）430 ul1M Tris-HCl（pH6.8）310 ul10%SDS25 ul四甲基乙二铵（四甲基乙二铵（TEMED）10 ul10%过硫酸铵（过硫酸铵（AP）25 ul总体积总体积2.5 ml3制作制作5.0%浓缩浓缩(nn su)胶胶 按照下表配好浓缩按照下表配好浓缩(nn su)胶，轻轻混匀胶，轻轻混匀，灌胶，灌胶2ml，插入梳子，聚合，插入梳子，聚合15 min。第28页/共34页第二十九页，共34页。闭电源。闭电源。第29页/共34页第三十页，共34页。第30页/共34页第三十一页，共34页。非诱导非诱导诱导诱导纯化纯化1 纯化纯化2 Marker100KD75KD50KD32KD25KD15KD37，OD=0.8，0.5mmol/L，IPTG，28 ，200rpm，6h第31页/共34页第三十