第八章免疫学检测方法

1、o 免疫学技术是利用抗原抗体特异性反应免疫学技术是利用抗原抗体特异性反应的原理建立的各种检测与分析技术，以的原理建立的各种检测与分析技术，以及建立这些技术的各种制备方法。及建立这些技术的各种制备方法。第八章第八章 免疫学检测方法免疫学检测方法检测技术种类检测技术种类 一、免疫学检测免疫学检测a 免疫凝集试验免疫凝集试验a 免疫沉淀试验免疫沉淀试验a 酶联免疫试验酶联免疫试验a 荧光免疫技术荧光免疫技术a 免疫电镜技术免疫电镜技术a 免疫印迹试验免疫印迹试验细菌凝集反应被广泛应用于细菌学的诊断。在凝集反应细菌凝集反应被广泛应用于细菌学的诊断。在凝集反应中，将参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集

2、素中，将参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。凝集法测定哈维氏弧菌抗体的效价凝集法测定哈维氏弧菌抗体的效价 管号管号1 12 23 34 45 56 67 7磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液0.90.90.90.90.90.90.90.90.90.90.90.91.01.0兔抗兔抗X X菌血清菌血清0.10.10.1(10.1(1) )0.1(20.1(2) )0.1(0.1(3)3)0.1(0.1(4)4)0.1(50.1(5) )0.00.01.1.稀释抗体稀释抗体2.2.玻片凝集法玻片凝集法 用用1ml1ml移液枪取移液枪取6 6号离心管中的溶液一滴滴在载玻片的一端，另一端加一滴号离心管中的

3、溶液一滴滴在载玻片的一端，另一端加一滴磷酸盐缓冲液，然后分别加一滴准备好的磷酸盐缓冲液，然后分别加一滴准备好的X X菌液。菌液。 牙签混匀，至于显微镜下观察，看是否有凝集块的形成。牙签混匀，至于显微镜下观察，看是否有凝集块的形成。 后取后取5 5、4 41 1号管的溶液逐个重复号管的溶液逐个重复1 1、2 2步骤。步骤。 取有凝集块变为无凝集块时取有凝集块变为无凝集块时, ,那个有凝集反应的试管作为抗体的效价。那个有凝集反应的试管作为抗体的效价。 沉淀凝集反应沉淀凝集反应双向免疫扩散沉淀线示意图双向免疫扩散沉淀线示意图琼扩反应中和实验荧光免疫技术 荧光免疫技术又称荧光抗体技术。它将免疫荧光免疫

4、技术又称荧光抗体技术。它将免疫化学和血清学的高度特异性和敏感性与显微技术化学和血清学的高度特异性和敏感性与显微技术的高度精确性相结合，为免疫学、临床组织化学的高度精确性相结合，为免疫学、临床组织化学及实验室诊断提供了一项其它方法尚不能取代的及实验室诊断提供了一项其它方法尚不能取代的、并有其独特风格的技术。目前，该技术已广泛、并有其独特风格的技术。目前，该技术已广泛应用于细菌、病毒、原虫以及真菌等的鉴定和相应用于细菌、病毒、原虫以及真菌等的鉴定和相应病的诊断，血清抗体的检查，病理组织学抗原应病的诊断，血清抗体的检查，病理组织学抗原、抗体和补体的鉴定及定位，免疫复合物病理的、抗体和补体的鉴定及定位

5、，免疫复合物病理的研究，细菌、病毒与细胞之间抗原关系的研究等研究，细菌、病毒与细胞之间抗原关系的研究等方面。其主要优点在于：特异性强，速度快，敏方面。其主要优点在于：特异性强，速度快，敏感性高；其缺点在于：非特异性染色问题尚未解感性高；其缺点在于：非特异性染色问题尚未解决，结果判定的客观性不足，技术程序也比较复决，结果判定的客观性不足，技术程序也比较复杂。杂。1 1、原理、原理 荧光免疫技术是一种以荧光物质作为标记荧光免疫技术是一种以荧光物质作为标记物的免疫分析技术，荧光物质的分子在特定物的免疫分析技术，荧光物质的分子在特定条件下吸收激发光的能量后，分子呈激发态条件下吸收激发光的能量后，分子呈

6、激发态而极不稳定，其迅速回到基态时，以电磁辐而极不稳定，其迅速回到基态时，以电磁辐射形式释放出所有的光能，发射出波长较照射形式释放出所有的光能，发射出波长较照射光长的荧光。荧光免疫技术可分为荧光免射光长的荧光。荧光免疫技术可分为荧光免疫组织化学技术和荧光测定技术。荧光抗体疫组织化学技术和荧光测定技术。荧光抗体技术属于前者，它是利用某些荧光素通过化技术属于前者，它是利用某些荧光素通过化学方法与特异性抗体结合，形成的免疫复合学方法与特异性抗体结合，形成的免疫复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此借助荧光显微镜检测或定位被检抗原。其又借助荧光显微镜检测或定位

7、被检抗原。其又可分为直接荧光抗体法、间接荧光抗体法和可分为直接荧光抗体法、间接荧光抗体法和补体荧光抗体法。补体荧光抗体法。荧光色素o 异硫氰酸荧光素（FITC）o 四乙基罗丹明（RB200）o 四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC)1、荧光抗体染色方法、荧光抗体染色方法 直接法直接法 间接法间接法2、荧光抗体技术的应用、荧光抗体技术的应用 在细菌学诊断中的应用在细菌学诊断中的应用 在病毒感染诊断中的应用在病毒感染诊断中的应用 其它方面的应用其它方面的应用间接荧光抗体法（IFAT）操作步骤如下：（1）单层血细胞滴片，室温晾干，放入丙酮中固定10min。室温晾干。（2）以小白鼠抗血清（或杂交瘤细胞上

8、清液）为第一抗体，加在血细胞抗原上。37湿盒中孵育45min。（3）0.01M PBS洗三次，每次5min。（4）加第二抗体IgG-FITC ，37湿盒中孵育45min。（5）0.01M PBS洗三次，每次5min。（6）甘油封片，荧光镜下观察，拍照。间接免疫荧光法检测对虾白斑症病毒病间接免疫荧光法检测对虾白斑症病毒病间接免疫荧光法检测淋巴囊肿病毒间接免疫荧光法检测淋巴囊肿病毒直接ELISA间接ELISA间接酶联免疫吸附试验间接酶联免疫吸附试验操作步骤如下：操作步骤如下：（1 1）分别以不同单抗为第一抗体，加在血细胞抗原上。）分别以不同单抗为第一抗体，加在血细胞抗原上。3737湿盒中孵育湿盒中

9、孵育60min60min。（2 2）0.01M PBS0.01M PBS洗三次，每次洗三次，每次5min5min。（3 3）加）加AP-IgG AP-IgG 为第二抗体，为第二抗体，3737湿盒中孵育湿盒中孵育45min45min。（4 4）0.01M PBS0.01M PBS洗三次，每次洗三次，每次5min5min。（5 5）加）加NBT/BCIPNBT/BCIP底物缓冲液发色底物缓冲液发色10min10min，（6 6）出现颜色加终止液终止反应。）出现颜色加终止液终止反应。 （7 7）用酶标分析仪在）用酶标分析仪在405nm,405nm,处测定各孔的吸光度，计算处测定各孔的吸光度，计算P

10、PN N（样品光吸收值（样品光吸收值与阴性对照的值），判定与阴性对照的值），判定ELISAELISA反应结果。大于反应结果。大于2.12.1时可判断为阳性。时可判断为阳性。以最大显色至阳性的显色孔以最大显色至阳性的显色孔50%50%反应孔的抗体稀释倍数为抗体效价反应孔的抗体稀释倍数为抗体效价。 图 DOT BLOT方法筛选结果图。免疫组织化学方法定扇贝血细胞分布细胞免疫化学法检测病毒感染四、四、Western blot 是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。 原理及步骤原理及步骤 样品样品 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离

11、蛋白 （SDS-PAGE ) 转移（印迹）于硝酸纤维素膜转移（印迹）于硝酸纤维素膜 加抗体检测某种特异性蛋白质加抗体检测某种特异性蛋白质West Blot 图：淋巴囊肿病毒与抗血清的Western blotting结果免疫电镜技术免疫电镜技术（免疫电镜技术（immune electron microscopic techniqueimmune electron microscopic technique）是一种将免疫学技术与电子显微镜技术相结合的血清学方是一种将免疫学技术与电子显微镜技术相结合的血清学方法，能使抗原在分子水平上进行定位。它实际上是将细胞法，能使抗原在分子水平上进行定位。它实际上

12、是将细胞水平的荧光抗体技术的基本原理应用于分子水平上。这一水平的荧光抗体技术的基本原理应用于分子水平上。这一技术的发明使抗原和抗体的定位研究达到了亚细胞或分子技术的发明使抗原和抗体的定位研究达到了亚细胞或分子水平。主要有以下几种技术。水平。主要有以下几种技术。铁蛋白抗体法铁蛋白抗体法酶标记抗体法酶标记抗体法重金属标记抗体法重金属标记抗体法图 胶体金标记免疫电镜结果(A) (D) bar = 200 nm; (B) (C) bar = 100 nm胶体金免疫技术o 胶体金是氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸等作用下的水溶液，具有高电子密度，并能与多种大分子发生物理吸附，因此，不但所有的大分子物质都可

13、被金标记，而且标记后大分子物质活性不发生改变。o 当抗原和金标抗体反应时，肉眼可见红色或粉红色斑条（点）,在显微镜下观察，抗原抗体结合处为黑褐色的颗粒。 o 斑点免疫金渗滤法（斑点免疫金渗滤法（DIGFA）的应用）的应用 与研究进展与研究进展 是是20世纪八十年代发展起来的一种免疫学检世纪八十年代发展起来的一种免疫学检 测方法，具有简便、快速、准确等优点。目前在测方法，具有简便、快速、准确等优点。目前在 医学检验中主要应用于检测医学检验中主要应用于检测 HBsAg、HCG 和和HIV等。等。斑点免疫金渗滤法原理斑点免疫金渗滤法原理： NCM为固相载体-通过渗滤-抗原与抗体在膜上快速反应-标记的

14、胶体金堆积显色。胶体金胶体金抗体抗体抗原抗原NCM吸水垫吸水垫 临床应用：临床应用：v 间接法测抗体：间接法测抗体： NCM 抗原-样品抗体-金标抗抗体显色v 夹心法测抗原夹心法测抗原： NCM多抗-样品抗原-金标单抗显色。 直接法检测抗原直接法检测抗原 NCM病毒病毒-金标单抗显色金标单抗显色 DIGFA步骤简化、时间缩短。 v DIGFA检测操作程序检测操作程序o2l检测样品-NCM-直径2mm点-晾干； 100l封闭液，渗入； 100l的金标抗体，渗入；o100l 的0.01M PBS-T（含0.05%Tween-20），渗入； 检测结果：红色斑点的为阳性，无红色斑点的为阴红色斑点的为阳

15、性，无红色斑点的为阴性性。 阳性代表检测样品中有病毒，阴性则无。 DIGFA检测结果检测结果, 红色斑点的为病毒阳性红色斑点的为病毒阳性,无红色斑点的为病毒阴性。无红色斑点的为病毒阴性。The result of DIGFA, red dot shows there is WSSV, otherwise, there is no WSSV. 免疫金标层析法的应用与研究进展免疫金标层析法的应用与研究进展 o 检测试纸的原理是：采用夹心免疫层析原理，即由检测试纸的原理是：采用夹心免疫层析原理，即由金标单抗同检测样品液中的抗原反应，形成由金标金标单抗同检测样品液中的抗原反应，形成由金标单抗单抗-抗原

16、复合物，当该复合物层析至硝酸纤维素抗原复合物，当该复合物层析至硝酸纤维素膜上预先包被在检测线上的另一种单抗处时，此处膜上预先包被在检测线上的另一种单抗处时，此处的抗体会识别该复合物中抗原，反应的结果便形成的抗体会识别该复合物中抗原，反应的结果便形成了金标单抗了金标单抗+抗原抗原+包被单抗的夹心结构，最终是包被单抗的夹心结构，最终是金标单抗上的胶体金颗粒在此固定并累积出现肉眼金标单抗上的胶体金颗粒在此固定并累积出现肉眼可见的红色线，未反应的金标单抗则仍继续层析前可见的红色线，未反应的金标单抗则仍继续层析前行行,当到达点预先包被在质控线羊抗鼠抗体处时，金当到达点预先包被在质控线羊抗鼠抗体处时，金标

17、单抗被其结合住，从而在此处也出现由胶体金颗标单抗被其结合住，从而在此处也出现由胶体金颗粒固定并累积而显现出肉眼可见的红色线，结果是粒固定并累积而显现出肉眼可见的红色线，结果是：检测线显示红色表示样品阳性；检测线不显示红：检测线显示红色表示样品阳性；检测线不显示红色，表示样品阴性。质控线显示红色，表示试纸有色，表示样品阴性。质控线显示红色，表示试纸有效；质控线处不显示红色，说明试纸失效，即或是效；质控线处不显示红色，说明试纸失效，即或是金标单抗、或是羊抗鼠抗体失活，检测结果无效。金标单抗、或是羊抗鼠抗体失活，检测结果无效。该试纸条构成:载体板7；在该载体板7的两端部，分别设有加样端4吸水层和手持

18、端1吸水层；在该载体板7中部段设有硝酸纤维膜的检测层2，在该检测层2与加样端4吸水层交界处，设有载有金标单抗E的玻璃纤维层块3，该层块3一端部分设置在加样端4吸水层之下，其另一端部分设置在检测层2之上；在与该层块3延续的检测层2上设有检测线6和质控线5，该检测线6和质控线5处分别包被有抗病毒单抗和羊抗鼠IgG。 用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光 。 由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分

19、光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。 直接化学发光免疫分析发光Y YY磁微粒被测抗原+抗体+带丫啶酯标记物抗体YYYYYYYYYYY冲洗后（1）加入H2O2（pH10）直接化学发光的机理磁微粒模式图YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特点已结合的抗原和抗体与未结合部分的易分离磁微粒技术五、聚合酶链反应（五、聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR） o PCR是模拟体内是模拟体内DNA复制复制条件，应用条件，应用DNA聚合酶反聚合酶反应，特异性扩增某一应，特异性扩增某一DNA片段的技术。体外程序化片

20、段的技术。体外程序化的的DNA合成技术。合成技术。PCRACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAAStep3 : Extension 延伸72CCGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaq PolymeraseTaq PolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA原原 理：理：1) 合成待扩增区域两端已知序列，与模板合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度；片段的长度；2) 反应体系：反应体系：DNA模板，模板，dNTP，Taq DNA聚聚合酶，合酶，buffer3) 反应程序：反应程序： 变性变性 ( 9495oC) 复性复性 延伸延伸 ( 3755 oC) ( 7072 oC ) 72 oC延伸延伸10min 30-35cycles DNA扩增扩增100万倍万倍P