第二章纯培养和显微技术

1、蚌埠学院 食品与生物工程系1第二章 纯培养和显微技术第二章 纯培养和显微技术纯培养技术&显微技术?-研究微生物的最基本的方法研究微生物的最基本的方法蚌埠学院 食品与生物工程系2微生物的五大微生物的五大特点特点：1）结构简单，体积小，表面积/体积比值大；2）吸收多、转化快，代谢活力强；3）生长旺，繁殖快；4）变异易，适应性强；5）分布广、种类多。蚌埠学院 食品与生物工程系3微生物的基本特点： 小！绝大多数情况下都是利用微生物的绝大多数情况下都是利用微生物的群体群体来研究其属性来研究其属性微生物的物种一般也是以微生物的物种一般也是以群体群体的形式进行繁衍、保存的形式进行繁衍、保存蚌埠学院

2、食品与生物工程系4培养技术培养技术在微生物学中具有重要意义！在微生物学中具有重要意义！纯培养技术纯培养技术是进行微生物学研究的基础！是进行微生物学研究的基础！无菌技术无菌技术是保证微生物学研究正常进行的关键！是保证微生物学研究正常进行的关键！关键技术关键技术微生物的基本特点：小！决定了决定了显微技术显微技术是进行微生物研究的另一项重要是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。只能通过显微镜才能进行观察和研究。蚌埠学院 食品与生物工程系5小纯培养技术一、无菌技术二、用固体培养基分离纯培

3、养三：用液体培养基分离纯培养四、单细胞（孢子）分离五、选择培养分离六、二元培养物七、菌种保藏蚌埠学院 食品与生物工程系6研究微生物“看到”微生物在群体水平上在个体水平上显微技术一、显微镜的种类及其原理二、显微观察样品的制备-本章主要内容蚌埠学院 食品与生物工程系7第一节 微生物的分离和纯培养 从自然状态下从自然状态下混杂混杂的群体中分离的群体中分离特定的某一种微生物特定的某一种微生物即即获得纯培获得纯培养养，是研究和利用微生物的第一步。，是研究和利用微生物的第一步。蚌埠学院 食品与生物工程系8一、无菌技术（aseptic technique)在分离、转接和培养纯培养时，防止其被其他微生物污染的

4、技术被称为无菌技术。灭菌（sterilization)：用于分离、培养微生物的器具和基质事先不含任何微生物；无菌操作：在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染；1、微生物培养的常用器具及其灭菌蚌埠学院 食品与生物工程系9蚌埠学院 食品与生物工程系102、接种操作火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行（p14图2-1，或者下页图示）蚌埠学院 食品与生物工程系11接种操作：无菌操作接种工具：白金or 镍铬合金接种环/针(p14, 图2-1), 灼烧灭菌。灼烧灭菌。无菌操作：蚌埠学院 食品与生物工程系12二、用固体培养基分离纯培养蚌埠学院 食品与生物工程系13培养基液体培养基固体培养基半固体培养基琼脂琼脂菌

5、落（colony）： 单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。蚌埠学院 食品与生物工程系14众多菌落连成一片菌苔（lawn）平板（plate）：又称为培养平板（culture plate)：蚌埠学院 食品与生物工程系15菌落或菌苔稳定的特征（形状、颜色等），可成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。（见P15， 图2-3）蚌埠学院 食品与生物工程系16蚌埠学院 食品与生物工程系17各种微生物形成的菌落特征分离纯培养物的基本原理：单个的细胞与其他细胞分离开；供给细胞营养和合适的条件，使其生长。蚌埠学院 食品与

6、生物工程系18使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法：稀释！稀释！稀释方式平板划线法-Streak plate method倾注平板法-Pour plate method涂布平板法-Spread plate method1、平板划线法：蚌埠学院 食品与生物工程系19蚌埠学院 食品与生物工程系20蚌埠学院 食品与生物工程系21蚌埠学院 食品与生物工程系222. 倾注平板法3. 涂布平板法获得最佳分离效果时，菌落密度100个平板较合适。而一般的起始菌液浓度可达到108-109个mL，因此需要稀释，因此切实可行的稀释方法是：系列稀释法（serial dilution)常用的系列稀释法为：1

7、0 倍或者100倍系列稀释蚌埠学院 食品与生物工程系2310 倍系列稀释蚌埠学院 食品与生物工程系24蚌埠学院 食品与生物工程系25蚌埠学院 食品与生物工程系26蚌埠学院 食品与生物工程系274、厌氧微生物的分离厌氧罐（化学、物理或生物除氧）蚌埠学院 食品与生物工程系28厌氧手套箱严格厌氧菌稀释摇管法蚌埠学院 食品与生物工程系29三、用液体培养基分离纯培养 液体培养基分离纯培养采用的仍然是稀释法，将液体高度稀释直到一支试管中都分配不到一个微生物（或者一支试管中只有一个微生物），才可能获得液体中的纯培养。 要达到该目的即必须在同一个稀释度即必须在同一个稀释度的的许多平行试管中，大多数（一般应超过

8、95%）表现为不生长。蚌埠学院 食品与生物工程系30四、单细胞（孢子）分离一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；操作难度与细胞或个体的大小成反比；蚌埠学院 食品与生物工程系31 所需要的微生物类群，在自然样品中，如果不占有数量上的优势时，采用前面介绍的稀释法几乎是不可能分离得到的。蚌埠学院 食品与生物工程系32如何对微生物群落中对微生物群落中数量占少数数量占少数的微生物的分离纯化？的微生物的分离纯化？选择分离培养五、选择培养分离1. 利用选择平板进行直接分离蚌埠学院 食品与生物工程系33实例培养基中不含N源：分离固氮菌；培养基加抗生素：分离抗性菌；高温下培养：分离嗜热细菌；蚌埠学院 食品与生物工

9、程系34. 利用鉴别平板进行直接分离蚌埠学院 食品与生物工程系35实例1牛奶平板：分离蛋白酶产生菌蚌埠学院 食品与生物工程系36. 富集培养 富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要其本质仍然是其本质仍然是选择培养基选择培养基/ /生长条件生长条件的作用。的作用。蚌埠学院 食品与生物工程系37蚌埠学院 食品与生物工程系38蚌埠学院 食品与生物工程系39六、二元培养物纯培养物 混合培养物 二元培养物蚌埠学院 食品与生物工程系40二元培养物：由两种具有特定关系的微生物组成的混合培养物。培养物中只含有二种微生物，而且是有意

10、识培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系，如寄生、伴生的保持二者之间的特定关系，如寄生、伴生和捕食。和捕食。v病毒和宿主细胞二者具有二者具有严格的寄生关严格的寄生关系系，二元培，二元培养物是保存病毒的有效途径，在实验室条件下可以认为接近于纯培养物。v纤毛虫、变形虫和粘细菌与其他微生物与其他微生物属于属于猎食猎食关系，二元培养方法是分离纯化此类微生物的有效技术之一。蚌埠学院 食品与生物工程系41蚌埠学院 食品与生物工程系42蚌埠学院 食品与生物工程系43蚌埠学院 食品与生物工程系44第二节 显微镜和显微技术蚌埠学院 食品与生物工程系45几个基本概念：蚌埠学院 食品与生物工

11、程系46蚌埠学院 食品与生物工程系47尼康E-600显微镜几个基本概念的意义蚌埠学院 食品与生物工程系48分辨率（力)（R)显微镜能够分辨两点之间最小距离能力。能够分辨的距离越小，分辨率越高，反之越低。蚌埠学院 食品与生物工程系49光学理论依据光学理论依据德国理学家Ernst Abbe，在19世纪70年代建立的在Abbe的公式中，两物体之间的最小可分辨距离被称为最小距离（d）最小距离最小距离=0.5 /nsin = 0.5 /NA蚌埠学院 食品与生物工程系50分辨率（R) 1/d公式解析：所用光源的光波波长，是影响分辨率的最主要因素。: 为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离蚌埠学院

12、 食品与生物工程系51蚌埠学院 食品与生物工程系52vn sin n sin = :n sin n sin : 被称为数值口径（被称为数值口径（Numerical Numerical Aperture, NA)Aperture, NA)它是决定物镜性能的最重要的指标。v获得最小分辨距离提高分辨率的措施：减短光波波长增加镜口角增加介质的折射率蚌埠学院 食品与生物工程系53光学显微镜物镜的特性蚌埠学院 食品与生物工程系54 普通光学显微镜又称明视野显微镜，其照明光线直接进入视野，属透射照明。活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的。不易看清楚。v解决的措施？解决的措施？改造显微镜（不同种类的显微镜）改

13、造观察的样品（染色技术）；蚌埠学院 食品与生物工程系552. 暗视野显微镜 暗视野显微镜利用特殊的聚光器对样品实行斜射照明，其目的是使射向样品上的直射光无法进入物镜，能够进入物镜的是样品上的反射光和折射光，因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的，同样可以增加反差。即使所观察微粒的尺寸小于显微镜的分辨率，仍然可以发现其存在。蚌埠学院 食品与生物工程系56明、暗视野显微镜的区别在于： 投射在标本上的光线的照射方式不同。蚌埠学院 食品与生物工程系57蚌埠学院 食品与生物工程系58暗视野显微镜常常用来观察活细菌的运动性。即使小于分辨率的颗粒仍有可能被观察到，能见到小至4-200nm 的微粒子，分辨率可比

14、普通显微镜高50倍。蚌埠学院 食品与生物工程系593. 相差显微镜v光的波长长短具体表现为颜色差别，光的振幅高低具体表现为明亮程度的不同。v由于微生物细胞个体微小，含水量大，与背景反差小，光线透过标本时，光的波长和振幅发生的改变不明显，无法被眼睛识别。因此利用:普通光学显微镜：观察时常常采用染色的方法增加细菌与背景的反差（利用了标本的颜色变化-波长的改变）。暗视野显微镜：则利用了明暗反差。蚌埠学院 食品与生物工程系60v实际上，标本各部分厚薄、密度不同，光线通过时直射光和衍射光的光程产生差别，导致光波相位的改变（即出现相位差）。这就是相差的来源。光的相位差肉眼无法感觉，那麽相差显微镜是如何让人

15、的眼睛感受到相位差的变化？具体表现在颜色上还是表现在明亮程度上的变化呢？蚌埠学院 食品与生物工程系61v相差显微镜配备了特殊的光学装置，利用光的干涉现象，将光的相位差转变成人眼可辨的振幅差（明暗差），形成反差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。蚌埠学院 食品与生物工程系62v相差显微镜配备了特殊的光学装置，主要是环状光圈和相板。（位置以及作用）环状光圈相板（相差物镜头， Ph)调焦望远镜蚌埠学院 食品与生物工程系63v利用光的干涉现象，将光的相位差转变成人眼可辨的振幅差（明暗差），形成反差（实际上，相位推迟1/20波长时，合成波的变化就已经较明显，可以被识别）。由于反差的基

16、础是细胞不同部位的密度差异，因此相差显微镜很适合观察活的细胞以及细胞内的一些细微结构。此技术突破使其发明人F. Zernike 获得了1953年的诺贝尔物理学奖。蚌埠学院 食品与生物工程系64观察结果比较蚌埠学院 食品与生物工程系65观察结果比较蚌埠学院 食品与生物工程系664.荧光显微镜v细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可激发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一蚌埠学院 食品与生物工程系67蚌埠学院 食品与生物工程系68蚌埠学院 食品与生物工程系69v荧光显微镜和普通光镜的

17、区别：光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护眼睛。v应用领域：免疫学，环境微生物学，分子生物学等。蚌埠学院 食品与生物工程系70电子显微镜光镜的最高分辨率可达到0.2m，这种局限是由可见光的性质决定的，与显微镜自身的性能无关.蚌埠学院 食品与生物工程系71电子显微镜是根据电子光学原理，用（1）电子束代替光束（2）电子透镜代替光学透镜大大提高了分辨率和放大倍数，可以观察物质的细微结构。v电子束的波长与加速电压有关。当加速电压为50100千伏时，电子束波长约为0.00530.0037纳米。由于电子束的波长远

18、远小于可见光的波长，所以即使电子束的锥角仅为光学显微镜的1，电子显微镜的分辨本领仍远远优于光学显微镜。蚌埠学院 食品与生物工程系72v电子束的波长约： 0.005nm (光镜：400nm),v提高10万倍；v而实际的分辨率比光镜提高约： 1000倍v电子显微镜因需在真空条件下工作，所以很难观察活的生物，而且电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤。v其他的问题，如电子枪亮度和电子透镜质量的提高等问题也有待继续研究。蚌埠学院 食品与生物工程系73v电子显微镜由镜筒、真空系统和电源柜三部分组成。镜筒主要有电子枪、电子透镜、样品架、荧光屏和照相机构等部件，这些部件通常是自上而下地装配成一个柱体；真空系

19、统由机械真空泵、扩散泵和真空阀门等构成，并通过抽气管道与镜筒相联接；电源柜由高压发生器、励磁电流稳流器和各种调节控制单元组成。蚌埠学院 食品与生物工程系74v电子透镜是电子显微镜镜筒中最重要的部件，现代电子显微镜大多采用电磁透镜，其作用与玻璃凸透镜使光束聚焦的作用相似，所以称为电子透镜。电子枪能发射并形成速度均匀的电子束。蚌埠学院 食品与生物工程系75电子显微镜按结构和用途可分蚌埠学院 食品与生物工程系765. 透射电子显微镜； 6. 扫描电子显微镜v与光学显微镜的差异：电子波代替了光源，波长更短；采用电磁圈“聚光器”使“光线”汇聚、聚焦；形成的是电子图像，需要用感光屏显示或者感光胶片记录。电

20、镜镜筒中要求高真空（电子运行中如遇到游离的气体分子会因碰撞而发生偏转，导致物象散乱不清）；蚌埠学院 食品与生物工程系77蚌埠学院 食品与生物工程系78v透射电子显微镜：电子束穿过薄切片；v扫描电子显微镜：观察样品的表面结构。蚌埠学院 食品与生物工程系79蚌埠学院 食品与生物工程系807. 扫描隧道显微镜v原理：量子力学中的隧道效应。v金属探针对样品表面极近距离扫描（0.5-2 nm)，探针与样品之间加零点几伏的电压，将产生纳安级的隧道效应电流。该电流对探针与样品之间的距离非常非常敏感，距离改变0.3nm，电流将改变1000倍。控制扫描电流或者扫描高度恒定，记录电压和电流的变化而了解样品的表面形

21、貌特征。蚌埠学院 食品与生物工程系81v优点：分辨率高：是目前分辨率最高的显微镜，其横向分辨率达到0.1-0.2 nm，纵向可达到0.001nm。可保持样品原貌：由于扫描时不接触样品，又没有高能电子束轰击，原则上可避免样品变形。可以在真空以及保持样品生理条件的大气甚至是液体环境下工作。蚌埠学院 食品与生物工程系82应用：直接观察大分子，如DNA、RNA和蛋白质等；生物膜、病毒、古生菌的细胞壁等超微结构。8、原子力显微镜（AFM）v利用细小探针对样品表面进行恒定高度扫描，但是不产生隧道电流。而是通过激光装置监测探针随样品表面的升降变化，获取样品表面形貌特征。v特点：可以对不具有导电性，或者导电性

22、能较差的样品进行观察。 蚌埠学院 食品与生物工程系83蚌埠学院 食品与生物工程系84蚌埠学院 食品与生物工程系85二、显微观察样品的制备v显微技术的重要环节，直接影响观察效果显微技术的重要环节，直接影响观察效果结合显微镜的特点结合显微镜的特点生物样品的特点生物样品的特点样品的生理结构保持稳定样品的生理结构保持稳定提高反差提高反差1、光学显微镜的制样v光学显微镜是生物学研究的最常用工具光学显微镜是生物学研究的最常用工具v基本使用方法：基本使用方法：活体观察活体观察、染色观察染色观察蚌埠学院 食品与生物工程系86蚌埠学院 食品与生物工程系87活体观察v在显微镜（明视野、暗视野或相差显微镜）在显微镜

23、（明视野、暗视野或相差显微镜）下对微生物活体进行直接观察下对微生物活体进行直接观察v特点：避免对微生物细胞结构的破坏，可用避免对微生物细胞结构的破坏，可用于研究运动能力、摄食特性、生长过程中的于研究运动能力、摄食特性、生长过程中的形态变化，如细胞分裂、芽孢萌发等动态过形态变化，如细胞分裂、芽孢萌发等动态过程。程。v常用的方法：压滴法压滴法、悬滴法悬滴法、菌丝埋片法菌丝埋片法v压滴法：将菌悬液滴于载玻片上，加盖将菌悬液滴于载玻片上，加盖盖玻盖玻片片后立即进行显微镜观察；后立即进行显微镜观察；v悬滴法：在盖玻片中央加一小滴菌悬液后反在盖玻片中央加一小滴菌悬液后反转置于特制的凹玻载片上后进行显微镜观

24、察转置于特制的凹玻载片上后进行显微镜观察。为防止液滴蒸发变干，一般还应在盖玻片。为防止液滴蒸发变干，一般还应在盖玻片四周加封凡士林；四周加封凡士林；v菌丝埋片法：将无菌小块玻璃纸铺于平板表将无菌小块玻璃纸铺于平板表面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，经培养，面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，经培养，取下玻璃纸置于载玻片上，用显微镜对菌丝取下玻璃纸置于载玻片上，用显微镜对菌丝的形态进行观察。的形态进行观察。蚌埠学院 食品与生物工程系88蚌埠学院 食品与生物工程系89染色观察v微小而透明的细菌细胞，如何观察呢？常见的碱性染料：结晶紫、番红、美兰、孔雀绿、中性红。常见的酸性染料：刚果红、伊红、品红、藻红。蚌埠

25、学院 食品与生物工程系90蚌埠学院 食品与生物工程系91（参见P26）蚌埠学院 食品与生物工程系92简单染色水洗、吸干涂片干燥固定染色染色1min镜检蚌埠学院 食品与生物工程系93革兰氏染色法vThe Gram-stain technique was developed The Gram-stain technique was developed by the Danish bacteriologist Christian by the Danish bacteriologist Christian Gram in 1884. It divides bacteria into Gram in

26、1884. It divides bacteria into 2 groups, Gram-positive (G2 groups, Gram-positive (G) and the ) and the Gram-negative (GGram-negative (G) )v1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染v2、用碘液进行媒染，其作用是提高染料和细胞间的相互作用，使二者结合得更牢固。v3、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细胞呈无色。v4、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对涂片进行复染。例如沙黄，它使原来

27、无色的革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革兰氏阳性细菌继续保持深紫色蚌埠学院 食品与生物工程系94v注意：注意：染色前必须先对涂在载玻片上的样品进染色前必须先对涂在载玻片上的样品进行固定，其目的有二：行固定，其目的有二：v 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；v 二是增加其对染料的亲和力。二是增加其对染料的亲和力。v常用固定方法：常用固定方法：酒精灯火焰加热酒精灯火焰加热和和化学固定化学固定。固定时应注意尽量固定时应注意尽量保持细胞原有形态保持细胞原有形态，防止细防止细胞膨胀和收缩胞膨胀和收缩。蚌埠学院 食品与生物工程系95蚌埠学院 食品与生物工程系96Gra

28、m stain of G+ Staphylococcus cells. Gram stain of G- E. coli cells蚌埠学院 食品与生物工程系97金黄色葡萄球菌和大肠杆菌革兰氏染色结果2、电子显微镜的制样v生物样品在进行电镜观察前必须进行生物样品在进行电镜观察前必须进行固定固定和和干燥干燥，否则镜筒中的，否则镜筒中的高真空会导致其严重脱高真空会导致其严重脱水，失去样品原有的空间构型水，失去样品原有的空间构型。v由于构成生物样品的主要元素对电子的由于构成生物样品的主要元素对电子的散射散射与吸收的能力均较弱与吸收的能力均较弱，在制样时一般都需要，在制样时一般都需要采用采用重金属盐染色或喷镀重金属盐染色或喷镀，以，以提高其在电镜提高其在电镜下的反差下的反差，