色谱-质谱联用技术及其应用

1、1色谱色谱-质谱联用技术及其应用质谱联用技术及其应用2授课内容授课内容l色谱技术色谱技术l质谱技术质谱技术l气相色谱气相色谱-质谱联用技术质谱联用技术l液相色谱液相色谱-质谱联用技术质谱联用技术3概述概述 色谱：化合物分离色谱：化合物分离质谱：纯物质结构分析质谱：纯物质结构分析色谱色谱-质谱联用：结合共同优点质谱联用：结合共同优点GC-MS；LC-MS；CE-MS关键点：关键点：接口技术接口技术m/z152943578599113142714色谱法由俄国植物学家色谱法由俄国植物学家茨维特分离植物色素茨维特分离植物色素时采用。时采用。 将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，加入石油醚将

2、植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带，因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于带，因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离无色物质的分离，“色谱色谱”二字虽已失去原来二字虽已失去原来含义，但仍被人们沿用至今。含义，但仍被人们沿用至今。一一 色谱技术色谱技术5色谱的原理色谱的原理定义：色谱是一种把混合物中定义：色谱是一种把混合物中多组分分离多组分分离的实验技术。的实验技术。即利用物质的即利用物质的物理化学性质物理化学性质建立的分离分析方法。建立的分离分析

3、方法。实质：分离实质：分离目的：定性或定量分析目的：定性或定量分析从20世纪30年代始6固定相和流动相固定相和流动相 l填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为称为固定相固定相；l自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相流动相；l装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱色谱柱。l当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互

4、作用的类型、强弱也有各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而不同，从而按先后不同的次序按先后不同的次序从固定相中流出。从固定相中流出。7按分离机理分类按分离机理分类分配色谱分配色谱：利用在流动相和固定相中分配系数的不同分离；：利用在流动相和固定相中分配系数的不同分离；吸附色谱吸附色谱：利用物理吸附性能的差异分离；：利用物理吸附性能的差异分离；离子交换色谱离子交换色谱：利用离子交换能力的差别分离；：利用离子交换能力的差别分离；空间排阻色谱空间排阻色

5、谱：利用排阻作用力的不同分离：利用排阻作用力的不同分离在常用的色谱中，常是在常用的色谱中，常是几种分离机制共同作用几种分离机制共同作用的的结果。结果。注意注意89色谱法的流出曲线及有关术语色谱法的流出曲线及有关术语10色谱峰所能提供的重要信息色谱峰所能提供的重要信息1 样品中所含组分的最少个数样品中所含组分的最少个数2 保留值保留值-定性分析定性分析3 色谱峰面积（或峰高）色谱峰面积（或峰高）-定量分析定量分析4 色谱峰的保留值和区域宽度色谱峰的保留值和区域宽度-评价色谱柱的分离效能评价色谱柱的分离效能5 根据相邻色谱峰之间的距离来选择合适的色谱分离条件根据相邻色谱峰之间的距离来选择合适的色谱

6、分离条件11 二二 质谱技术质谱技术 质谱分析法是通过对被测样品离子质谱分析法是通过对被测样品离子质荷比质荷比（m/z）的测定来进）的测定来进行分析的一种方法。行分析的一种方法。质荷比质荷比：指带电粒子的质量与所带电荷之比值。：指带电粒子的质量与所带电荷之比值。 被分析的样品首先要被分析的样品首先要离子化离子化，然后利用不同离子在，然后利用不同离子在电场或磁电场或磁场场运动行为的不同，把离子按运动行为的不同，把离子按m/z分开而得到质谱，并得到样品分开而得到质谱，并得到样品的的定性定量定性定量结果。结果。m/z15294357859911314271122.1 质谱的发展质谱的发展40年代年代

7、同位素测定和无机元素分析同位素测定和无机元素分析50年代年代有机物分析有机物分析60年代年代气相色谱气相色谱-质谱联用质谱联用80年代年代新的质谱技术新的质谱技术接口技术（基质辅助激光解吸电离源，接口技术（基质辅助激光解吸电离源，电喷雾电离源，大气压化学电离源）电喷雾电离源，大气压化学电离源）新质谱仪（液相色谱新质谱仪（液相色谱-质谱联用仪，质谱联用仪，富立叶变换质谱仪等）富立叶变换质谱仪等）目前质谱分析法已广泛地应用于化学、化工、材料、环境、药物、刑侦、目前质谱分析法已广泛地应用于化学、化工、材料、环境、药物、刑侦、生命科学、运动医学等各个领域。生命科学、运动医学等各个领域。 1911年年

8、世界第一台质谱装置（世界第一台质谱装置（J.J. Thomson） 70年代年代计算机技术引入计算机技术引入1316 质谱仪是通过对样品电离后产生的具有不同的质谱仪是通过对样品电离后产生的具有不同的 m/z m/z 的离的离子来进行分离分析的。子来进行分离分析的。 质谱仪包括质谱仪包括进样系统进样系统、电离系统电离系统、质量分析系统和检测质量分析系统和检测系统系统。 2.3 质谱仪的基本结构质谱仪的基本结构计算机数据计算机数据处理系统处理系统真空系统真空系统 加速区加速区进样系统进样系统离子源离子源质量分析器质量分析器检测器检测器 必须处于必须处于真空状态真空状态17l质谱仪的离子产生及经过系

9、统必须处于质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状态高真空状态。若。若真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、本底增高、图真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、本底增高、图谱复杂化、干扰离子源的调节、加速极放电等问题。谱复杂化、干扰离子源的调节、加速极放电等问题。l一般质谱仪都采用一般质谱仪都采用机械泵机械泵预抽真空后，再用高效率预抽真空后，再用高效率扩散扩散泵泵连续地运行以保持真空。现代质谱仪采用连续地运行以保持真空。现代质谱仪采用分子泵分子泵可获可获得更高的真空度。得更高的真空度。2.3.1 真空系统真空系统18真空系统为早期的维护反馈提供数字化控制双分子涡轮泵可快速抽真空和进行稳定操作19

10、进样系统目的是进样系统目的是高效重复地将样品引入到离子源中高效重复地将样品引入到离子源中并且不能造成真空度的降低。并且不能造成真空度的降低。l进样方式：进样方式：1、直接进样：直接进样：直接引入法是将低挥发性样品直接装在直接引入法是将低挥发性样品直接装在探针探针上，将探针上，将探针送入真空腔内，然后给探针通大电流加热，使探针的温度急剧上升至数送入真空腔内，然后给探针通大电流加热，使探针的温度急剧上升至数百度（一般不超过百度（一般不超过 400 ），），样品样品分子受热后挥发形成蒸气，该蒸气受分子受热后挥发形成蒸气，该蒸气受真空腔内真空梯度的作用被直接引入到离子源中离子化真空腔内真空梯度的作用被

11、直接引入到离子源中离子化。2、间接进样间接进样 （GC、LC、CE）：）：这种进样系统的研究热点之一就这种进样系统的研究热点之一就是质谱和色谱之间的是质谱和色谱之间的接口接口技术技术2.3.2 进样系统进样系统20 离子源的作用是将欲分析样品离子源的作用是将欲分析样品电离电离，得到带有样品，得到带有样品信息的信息的离子离子。2.3.3 离子源离子源21电子轰击电离电子轰击电离 Electron Impact Ionization, EI化学离子化化学离子化 Chemical Ionization, CI场电离，场解吸场电离，场解吸 Field Ionization FI, Field Deso

12、rption FD快原子轰击快原子轰击 Fast Atom Bombardment, FAB基质辅助激光解析电离基质辅助激光解析电离 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI电喷雾电离电喷雾电离 Electrospray Ionization, ESI大气压化学电离大气压化学电离 Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI离子化方法离子化方法22电子轰击电离电子轰击电离 EI EI源应用最为广泛源应用最为广泛，它主要用于挥发性样品的电离。，它主要用于挥发性样品的电离。 原理：由原理：由

13、GC或直接进样杆进入的样品，以气体形式进入离子源，由灯或直接进样杆进入的样品，以气体形式进入离子源，由灯丝发出的电子与样品分子发生碰撞使样品分子电离。丝发出的电子与样品分子发生碰撞使样品分子电离。 在离子室内施加在离子室内施加70V电压，使电子得到加速而进入电离室，当这些电子电压，使电子得到加速而进入电离室，当这些电子轰击电离室中的气体中的原子或分子时，有机物分子可能被打掉一个电子轰击电离室中的气体中的原子或分子时，有机物分子可能被打掉一个电子形成分子离子，也可能会发生化学键的断裂形成碎片离子。形成分子离子，也可能会发生化学键的断裂形成碎片离子。 由分子离子可以确定化合物分子量，由碎片离子可以

14、得到化合物的结由分子离子可以确定化合物分子量，由碎片离子可以得到化合物的结构信息。构信息。23但对有机物中相对分子质量较大或极性大，难汽化，但对有机物中相对分子质量较大或极性大，难汽化，热稳定性差的化合物，在加热和电子轰击下，分子易破碎，热稳定性差的化合物，在加热和电子轰击下，分子易破碎，难于给出完整的分子离子信息，这是难于给出完整的分子离子信息，这是EI源的局限性。源的局限性。24有些化合物稳定性差，用有些化合物稳定性差，用EI方式不易得到分子离子；方式不易得到分子离子；为了得到分子量可以采用为了得到分子量可以采用CI电离方式。电离方式。特点：特点：最强峰为准分子离子最强峰为准分子离子；谱图

15、简单；谱图简单；不适用难挥发试样不适用难挥发试样；+气体分子气体分子试样分子试样分子+准分子离子准分子离子电子电子(M+1)+;(M+17) +;(M+29) +;化学电离（化学电离（CI）25化学电离化学电离 CI反应气体可以是甲烷、异丁烷、氨等反应气体可以是甲烷、异丁烷、氨等。 以CH4为例：CI源工作过程中要引进一种反应气体。气体经过电子轰源工作过程中要引进一种反应气体。气体经过电子轰击，产生离子，再与试样相互碰撞，产生准分子离子。击，产生离子，再与试样相互碰撞，产生准分子离子。26M + CH5+ MH + + CH4 M + C2H5+ MH + + C2H4 M + C2H5+ M

16、 H + + C2H6 加合离子与样品分子反应：准分子离子QM + 生成的M+H +和 M-H +比样品分子M多一个H或少一个H，称为准分子离子。化学电离源是一种软电离方式，有些用EI方式得不到分子离子的样品，改用CI后可以得到准分子离子，因而可以求得分子量。27场致电离场致电离特点：特点：强电场将分子中拉出一个电子；强电场将分子中拉出一个电子；分子离子峰强；分子离子峰强；碎片离子峰少；碎片离子峰少；不适合化合物结构鉴定；不适合化合物结构鉴定；阳极+阴极d1mm不足：要求样品分子处于气态，灵敏度不高，应用逐渐减少。不足：要求样品分子处于气态，灵敏度不高，应用逐渐减少。以场电离以场电离Field

17、 Ionization（FI）为）为例例 在相距很近的阳极和阴极之间，施加在相距很近的阳极和阴极之间，施加700010000V的稳定直流电压，的稳定直流电压，在阳极的尖端附近产生在阳极的尖端附近产生107108Vcm-1的强电场，依靠这个电场把尖端附的强电场，依靠这个电场把尖端附近纳米处的分子中的电子拉出来，使之形成正离子，然后通过一系列静电近纳米处的分子中的电子拉出来，使之形成正离子，然后通过一系列静电透镜聚集成束，并加速到质量分析器中去。透镜聚集成束，并加速到质量分析器中去。28快原子轰击（快原子轰击（FAB） 它是利用一束中性原子轰击试样导致有机物分子电离而获得质谱的一它是利用一束中性原

18、子轰击试样导致有机物分子电离而获得质谱的一种软电离技术。这种电离方法使用的种软电离技术。这种电离方法使用的“快原子快原子”，通常是将惰性气体元，通常是将惰性气体元素氩先电离成素氩先电离成Ar+离子，氩气在电离室依靠放电产生氩离子，高能氩离离子，氩气在电离室依靠放电产生氩离子，高能氩离子经电荷交换得到高能氩原子流，子经电荷交换得到高能氩原子流，氩原子打在样品上产生样品离子氩原子打在样品上产生样品离子。电。电离过程中不必加热气化，因此离过程中不必加热气化，因此适合于分析大分子量、难气化、热稳定性适合于分析大分子量、难气化、热稳定性差的样品差的样品。例如肽类、低聚糖、天然抗生素等。例如肽类、低聚糖、

19、天然抗生素等。FAB源主要用于源主要用于磁式双聚焦质谱仪磁式双聚焦质谱仪 FAB是目前广泛使用的软电离技术，得到的质谱不仅有较强的准分子离是目前广泛使用的软电离技术，得到的质谱不仅有较强的准分子离子峰，而且有较丰富的结构信息。子峰，而且有较丰富的结构信息。29 MALDI可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子。可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子。 基本原理基本原理是将样品分散在基质分子中并形成晶体。当用激光照射是将样品分散在基质分子中并形成晶体。当用激光照射晶体时，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质晶体时，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质- -样品之间发生样品之间发生

20、电荷转移使得样品分子电离。电荷转移使得样品分子电离。 MALDI适用于适用于生物大分子生物大分子，如肽类，如肽类，核酸类化合物。可得到核酸类化合物。可得到准准分子离子峰，分子离子峰，碎片离子和多电荷离子较少碎片离子和多电荷离子较少. 基质辅助激光解析电离基质辅助激光解析电离 （MALDI）Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI ESI是近年来出现的一种新的电离方式。它主要应用于是近年来出现的一种新的电离方式。它主要应用于液相色谱液相色谱-质谱联质谱联用仪用仪。流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘；由于强。流出液在高电

21、场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘；由于强电场的作用，引发正、负离子的分离，从而生成带高电荷的液滴。在加热气电场的作用，引发正、负离子的分离，从而生成带高电荷的液滴。在加热气体（干燥气体）的作用下，液滴中的溶剂被汽化，随着液滴体积逐渐缩小，体（干燥气体）的作用下，液滴中的溶剂被汽化，随着液滴体积逐渐缩小，液滴的电荷密度超过表面张力极限（雷利极限），引起液滴自发的分裂，亦液滴的电荷密度超过表面张力极限（雷利极限），引起液滴自发的分裂，亦可称为可称为“库仑爆炸库仑爆炸”。直接产生样品离子，进入质量分析器。直接产生样品离子，进入质量分析器。电喷雾电离（电喷雾电离（ESI）31 ESI是一种是一

22、种软电离方式软电离方式，即便是分子量大，稳定性差的化，即便是分子量大，稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解，它适合于分析合物，也不会在电离过程中发生分解，它适合于分析极性极性强强的有机化合物。的有机化合物。 ESI的最大特点是的最大特点是容易形成多电荷离子容易形成多电荷离子。目前采用电喷雾。目前采用电喷雾电离，可以测量大分子量的蛋白质。电离，可以测量大分子量的蛋白质。32大气压化学电离源大气压化学电离源(APCI) APCI喷嘴的下游放置一个喷嘴的下游放置一个针状放电电极针状放电电极，通过放电，通过放电电极的高压放电，使空气电极的高压放电，使空气中某些中某些中性分子电离中性分子电离，产

23、，产生生H3O+，N2+，O2+ 和和O+ 等等离子，溶剂分子也会被电离子，溶剂分子也会被电离，这些离子与分析物分离，这些离子与分析物分子进行子进行离子离子-分子反应分子反应，使使分析物分子离子化分析物分子离子化。Corona Nebulizer APCIHPLCinlet+33 APCI主要用来分析主要用来分析中等极性中等极性的化合物。有些分的化合物。有些分析物由于结构和极性方面的原因，用析物由于结构和极性方面的原因，用ESI不能产生不能产生足够强的离子，可以采用足够强的离子，可以采用APCI方式增加离子产率，方式增加离子产率，可以认为可以认为APCI是是ESI的补充。的补充。APCI主要产

24、生的是主要产生的是单电荷离子单电荷离子，很少有碎片离子，很少有碎片离子，主要是主要是准分子离子准分子离子。 以上两种电离源主要用于以上两种电离源主要用于液相色谱液相色谱-质谱质谱联用仪联用仪。34各种离子源的相对适用性各种离子源的相对适用性35单聚焦质量分析器单聚焦质量分析器37单聚焦质量分析器单聚焦质量分析器在一定的在一定的B、V下，不同下，不同m/z 的离的离子其子其R不同，由离子源产生的离不同，由离子源产生的离子，经过分析器后可实现质量分子，经过分析器后可实现质量分离。离。 离子进入分析器后，由于磁场的作用，其运动轨道发生偏转改作圆周运离子进入分析器后，由于磁场的作用，其运动轨道发生偏转

25、改作圆周运动。其运动轨道半径动。其运动轨道半径R可由下式表示：可由下式表示： 上式中，上式中， m -离子质量离子质量 Z -离子电荷量离子电荷量 V -离子加速电压离子加速电压 B -磁感应强度磁感应强度38四极杆质量分析器四极杆质量分析器 47飞行时间质谱仪（飞行时间质谱仪（Time of Flight MS, TOF-MS） TOF-MS的核心部分是一个无场的离子漂移管的核心部分是一个无场的离子漂移管； 加速后的离子具有相同的动能 zVmv 2212/1)2(mzVv 492.3.5 检测系统检测系统 质量分析器分离并加以聚焦的离子束，质量分析器分离并加以聚焦的离子束，按按mm/ /z z的大小依次通过狭缝，到达收集器的大小依次通过狭缝，到达收集器, ,经接收放大后被记录。经接收放大后被记录。50 质谱仪的检测主要使用质谱仪的检测主要使用电子倍增器电子倍增器，也有的使用，也有的使用光光电倍增管电倍增管。由倍增器出来的电信号被送