重组DNA技术教学PPT课件

1、1基本概念 克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。DNA克隆第1页/共79页2基本概念技术水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）第2页/共79页3基本概念应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (r

2、ecombinant DNA) 。 DNA克隆第3页/共79页4基本概念 目的： 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。第4页/共79页5自然界DNA重组和基因转移是经常发生的 一、同源重组是最基本的DNA重组方式二、细菌的基因转移与重组接合作用转化作用三、病毒的作用第5页/共79页6重组DNA技术的发展简史19601970年重组DNA工具的研究90（载体、酶）。1972年，Berg 等第一次完成DNA体外重组实验。1973年，N.Cohen、W

3、.Boyer第一次完成克隆。1980年，重组胰岛素进入市场。1985年，Mulis完成PCR技术。1996年，克隆羊Dolly(1963童第周克隆鱼)。20世纪90年代启动人类基因组计划。第6页/共79页7第一节第一节 重组重组DNADNA技术的基本过技术的基本过程程 1.分2.切3.接4.转5.筛6.表达第7页/共79页8第二节第二节 重组重组DNA技术中常用工具酶技术中常用工具酶 工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNADNADNA连接酶连接酶催化催化DNADNA中相邻的中相邻的5 5 磷酸基和磷酸基和3 3 羟基末端之间形

4、成磷酸二酯键，羟基末端之间形成磷酸二酯键，使使DNADNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNADNA分子或片段连接分子或片段连接DNADNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNAcDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNADNA序列分析序列分析填补填补3 3 末端末端KlenowKlenow片段片段又名又名DNADNA聚合酶聚合酶I I大片段，具有完整大片段，具有完整DNADNA聚合酶聚合酶I I的的5 53 3 聚合、聚合、3 35 5 外切活性，而无外切活性，而无5 53 3 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNAcDNA第二链合第二链合成，双链

5、成，双链DNA 3DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNAcDNA替代替代DNADNA聚合酶聚合酶I I进行填补，标记或进行填补，标记或DNADNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基第8页/共79页9一、限制性核酸内切酶概念：是一类能识别双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，又称为限制酶。第9页/共79页1

6、0（一）限制性核酸内切酶的命名 Hin d 属 种 株 序Haemophilus influenzae Rd株流感嗜血杆菌d株的第三种酶第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表菌株；用罗马数字表示发现的先后次序。第10页/共79页11（二）限制性核酸内切酶的类型 型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶（应用广泛）型限制性核酸内切酶 作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA第11页/共79页12（三）型限制性核酸内切酶特点：型限制酶识别双链DNA中48个核苷酸组成的特定序列，从其识别序列内切割DNA分子中的

7、磷酸二酯键，产生含5-P和3-OH的产生粘性末端或平末端。功能：根据需要在特定的位点精确切割双链DNA分子。第12页/共79页13 识别序列特点： 回文结构(palindrome) 第13页/共79页14（1）产生5 突出粘性末端 (sticky end)EcoR I*GAATTC*CTTAAG*535 3*G*C T T A A 53 35 OHPA A T T C* G*5 3 35 P OH第14页/共79页15（2）产生3 突出粘性末端Pst I*CTGCAG*GACGTC*53535 33 5 OHP*C T G C A*G533 5 OHPA C G T C*G*第15页/共79页

8、16（3）产生平末端 (blunt end)*GATATC*CTATAG*53535335 OHP*GAT*CTA5335 OHPATC*TAG*EcoR 第16页/共79页17n同裂酶（isoschizomer） 又称异源同工酶，指来源不同识别序列相同的酶 n同尾酶（isocaudamer） 识别序列与切割位点相互有关的一类酶 n可变酶 此类酶是型限制酶的特例，识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过6个核苷酸第17页/共79页18(四）限制酶作用的影响因素 DNA底物的纯度 DNA的甲基化程度 DNA分子的结构 酶切反应的温度 酶切反应的时间 酶切反应的缓冲体系 第1

9、8页/共79页19名称名称 识别序列及切割位点识别序列及切割位点名称识别序列及切割点名称识别序列及切割点切割后产生切割后产生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后产生切割后产生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn 5GGTACC.3C

10、.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后产生平末端切割后产生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性内切核酸酶第19页/共79页20二、 连接酶(DNA ligase) 将两条双链DNA片段连接起来，实现DNA的体外重组功能： 催化两条双链DNA分子的互补粘性末端或平末端的5 磷酸基团与3 羟基形成磷酸二酯键第20页/共79页21第21页/共79页22第22页/共79页23常用的DNA连接酶1

11、.大肠杆菌DNA连接酶 2.T4 DNA连接酶第23页/共79页24DNA连接酶对黏性末端的连接效率远高于平末端的连接效率。连接黏性末端的温度一般在415。连接酶的用量在平末端连接高于黏末端。ATP的反应浓度：10mol/L1 mmol/L。载体与目标基因的摩尔数比值：1 101 3。影响DNA连接酶作用的因素第24页/共79页25三、DNA聚合酶 能够把脱氧核糖核苷酸连续地添加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用类型： 大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow片段 Taq DNA聚合酶 逆转录酶 第25页/共79页26四、其它修饰酶 1.末端脱氧核苷酸转移酶：主要作用是在外源

12、DNA片段及载体分子的3-OH加上互补的同聚物尾巴，形成人工黏性末端第26页/共79页27第27页/共79页282.多核苷酸激酶：在重组DNA技术中，多核苷酸激酶可用于标记DNA的5末端，也可使缺失5-P末端的DNA发生磷酸化作用。第28页/共79页293.碱性磷酸酶：能特异地切除DNA、RNA和dNTP上5磷酸基团。在重组DNA技术中，用碱性磷酸酶去除载体分子或DNA片段的5-P，以防止发生自身连接。第29页/共79页30第30页/共79页31第31页/共79页32第三节第三节 重组重组DNA技术中常用载技术中常用载体体 定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DN

13、A分子。 常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA第32页/共79页33克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。第33页/共79页34作为基因工程载体所需具备的基本条件能自主复制有多个单一酶切位点，称为多克隆位点（MCS），利于外源DNA分子插入具有两个以上的选择性遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定分子量小，以容纳较大的外源DNA拷贝数高 具有较高的遗传稳定性第34页/共79页35一、质粒载体 质粒 (plasmi

14、d)特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 第35页/共79页36（一）（一）pBR322pBR322质粒载体（克隆质粒载体（克隆6kb6kb） 第36页/共79页37（二） pUC19 质粒载体LacZ基因与-半乳糖苷酶X-gal，5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷MCS区段：来自M13噬菌体第37页/共79页38二、噬菌体（bacteriophage）载体 （一）噬菌体 (phage)载体（二）粘粒 (cosmid)载体（三）M13噬菌体载体第38页/共79页39 噬菌体插入较大外源DNA片段（23kb）第39页/共79页40n与质粒载体相比

15、，其突出优点是可插入较大外源DNA片段n噬菌体的感染效率远高于质粒载体的转化效率第40页/共79页41三、病毒载体质粒载体、噬菌体载体都是以原核细胞（如大肠杆菌）作为宿主细胞。近年来为适应真核细胞重组DNA技术的需要，特别是为实现真核基因表达或基因治疗的需要，已发展出用动物病毒改造的病毒载体。第41页/共79页42目前常用的病毒载体有整合型和游离型两类 逆转录病毒载体 （整合型）腺病毒载体 （游离型）第42页/共79页43病毒载体的改造带目标基因假病毒包装细胞目标基因第43页/共79页44三、人工染色体载体 酵母人工染色体载体（YAC）是第一个成功构建的人工染色体载体，用于在酵母细胞中克隆大片

16、段外源DNA。YAC可接受100kb2 000kb的外源DNA片段插入，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体。第44页/共79页45人工染色体载体包含的调控元件 着丝粒：以保证染色体在细胞分裂过程中正确地分配到子代细胞。端粒：作为染色体复制所必需的成分，可防止染色体被核酸外切酶降解而缩短。复制起始点和限制性酶切位点。YAC载体的两臂均带有选择标记。原核序列及调控元件：以便于在大肠杆菌中操作。第45页/共79页46第四节第四节 重组重组DNADNA技术基本原理技术基本原理基本原理目的基因的获取DNA导入受体细胞外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达 第46页/

17、共79页47一、目的基因的获得（一） 化学合成法（二）聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR)（三）从基因文库中筛选第47页/共79页48（一）（一） 化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其 产物的氨基酸序列由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列第48页/共79页49（二）聚合酶链反应 PCR法 RT-PCR法（三）从基因文库中筛选 基因组DNA文库 (genomic library) cDNA文库 (cDNA library)基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。第49页/共79页50限制酶切位点限制酶消

18、化 除去中间片段cos LR coscos L左臂R cos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库 第50页/共79页51mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 从cDNA文库获取目的基因 第51页/共79页52二、克隆载体的选择和构建目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。 第52页/共79页53三、目的基因的体外

19、重组 DNA体外重组本质上是一个酶促反应过程，在DNA连接酶的催化作用下，将外源DNA分子（目的基因）与载体DNA分子连接成一个重组分子的过程 第53页/共79页54（一）黏性末端连接（二）平末端连接（三）人工接头连接（四）同聚物加尾连接第54页/共79页55（一）黏性末端连接基本方法： 目的基因与载体分子经同一限制性核酸内切酶切割成具有相同黏性末端的DNA片段后，可通过黏末端互补配对，再借助DNA连接酶封闭缺口，形成完整的重组DNA分子 第55页/共79页56Bam H切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用 Bam H切割GCCTAG

20、GCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体DNA用Bam H切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接第56页/共79页57不同限制酶切位点的连接GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点Bg l切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEco

21、R+ Bg l双酶切Eco R+ Bg l双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶15C重组体第57页/共79页58（二）平末端连接限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端第58页/共79页59目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶15C重组体载体自连目的基因 自连第59页/共79页识别序列外源DNA酶切位点酶切位点EcoR酶切Pvu酶切粘性末端平末端双酶切载体DNA连接酶第60页/共79页61（三）人工接头连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 第61页/共79页人工接头及其应用CCGAATTCG G

22、GCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R第62页/共79页63（四）同聚物加尾连接在末端转移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。第63页/共79页645335载体DNA5335目的基因限制酶或机械剪切限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 353 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶-核酸外切酶末端转移酶+ dATP末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶15C重组体5第64页/共79页65四、重组

23、DNA分子的导入宿主细胞应具备的条件 处于感受态 对载体无严格限制 限制酶和重组酶缺陷 不对外源DNA进行修饰 能表达重组体所提供表型特征第65页/共79页66磷酸钙转染DEAE-葡聚糖介导转染电穿孔转染脂质体转染显微注射转化 转染 感染第66页/共79页67（一）根据重组载体的遗传表型进行筛选（二）限制性核酸内切酶酶切鉴定（三）核酸分子杂交法（四）PCR法（五）免疫化学检测法五、重组DNA分子的筛选与鉴定第67页/共79页68(插入失活法) 抗药性标记选择第68页/共79页69筛选重组体pUC18 第69页/共79页70表达体系的建立： 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化六、

24、克隆基因的表达第70页/共79页71其优点：简单、迅速、经济、适合大规模生产 。 E.coli表达体系的不足：不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体；很难表达大量可溶性蛋白。1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用)第71页/共79页72 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、不经济2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）第72页/共79页73第五节重组DNA技术与医学的关系非常密切并前景远大一、疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。 疾病基因发现的两个典型例子: 脆性X综合征Kallmann综合征第73页/共79页74二、生物制药 利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为21世纪的支柱产业。 美国Eli Lilly公司于1982年首先利用重组DNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代