色谱法概论1实用教案

1、课程内容一、色谱法概论二、经典液相色谱法（ LC ）三、气相色谱法（GC）四、高效液相色谱法（HPLC）五、毛细管电泳（CE）邮箱(yuxing)： 密码：405405第1页/共59页第一页，共59页。 定义：色谱法是一种物理或物理化学分离分析方法。是一种分离技术。 特点：适宜分离多组分的试样，效率高、应用广。 原理：利用各物质（组分）在两相（固定相、流动相）中具有不同的分配系数，当两相作相对运动(xin du yn dn)时，这些物质在两相中进行多次反复的分配来达到分离的目的。 完成这种分离分析的仪器为色谱仪。K=Cs/Cm色谱法概论(giln)第2页/共59页第二页，共59页。一、色谱法的

2、起源(qyun)和发展 1906年，俄国植物学家茨维特首次提出色谱法。 茨维特研究植物色素时使用的色谱原型装置，如右图。在一根玻璃管底部塞上棉花(min hua)，管内填入碳酸钙粉末，石油醚萃取液倒在碳酸钙上面，用石油醚冲洗。结果几种色素在管内展开形成5个色带。第一节 色谱法的起源、历程(lchng)及分类第3页/共59页第三页，共59页。 1931年库恩利用茨维特的色谱法分离了60多种胡萝卜素，；并从蛋黄只能够分离出叶黄素，从此吸附色谱法才迅速(xn s)为各国所注意。 1940年，Martin 和 Synge （英）提出液液分配色谱法； 1952年， James和 Martin 发表了从理

3、论到实践比较完整的气液色谱方法因而获得了1952年的诺贝尔化学奖。 1957年，Golay开创了毛细管柱气相色谱； 20世纪60年代，高效液相色谱； 20世纪80年代初，超临界流体色谱； 20世纪80年代末，毛细管电泳第4页/共59页第四页，共59页。 在分析化学领域，色谱法是一个相对年轻的分支学科。早期的色谱技术只是一种分离技术而已，与萃取、蒸馏等分离技术不同的是其分离效率高得多。当这种高效的分离技术与各种灵敏的检测技术结合在一起后，才使得色谱技术成为最重要的一种分析方法，几乎可以(ky)分析所有已知物质，在所有学科领域都得到了广泛的应用。色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作年代年代获奖学科

4、获奖学科获奖研究工作获奖研究工作1937化学类胡萝卜素化学，维生素A和B1938化学类胡萝卜素化学1939化学聚甲烯和高萜烯化学1950生理学、医学性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离1951化学超铀元素的发现1955化学脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1958化学胰岛素的结构1961化学光合作用时发生的化学反应的确认1970生理学、医学关于神经元触处迁移物质的研究1970化学糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化学核糖核酸化学酶结构的研究1972生理学、医学抗体结构的研究第5页/共59页第五页，共59页。第6页/共59页第六页，共59页。第7页/共59页第七页，共59

5、页。方方 法法项项 目目 数数 量量1985年版年版1990年版年版1995年版年版2000年版年版2005年版年版2010版版HPLC鉴别及鉴别及含测含测7811916971327 2496TLC鉴别及鉴别及含测含测未统计未统计未统计未统计未统计未统计未统计未统计1568 4075GC鉴别及鉴别及含测含测未统计未统计未统计未统计未统计未统计未统计未统计 4785 色谱法在中国药典(yodin)中的应用 第8页/共59页第八页，共59页。高效液相色谱高效液相色谱(s p)的的样品样品芬达橙汁汽水(qshu)水甜味剂人工香精(xingjng)(香橙)人工色素(柠檬黄)第9页/共59页第九页，共5

6、9页。高效高效(o xio)液相色谱液相色谱 - 组分分离组分分离芬达样品(yngpn)色谱(s p)图水甜味剂人工香精(香橙)人工色素(柠檬黄)第10页/共59页第十页，共59页。高效(o xio)液相系统液体传输液体样品高效液相系统高效液相系统高效液相色谱柱数据处理检测器第11页/共59页第十一页，共59页。检测器检测器硅胶(u jio)填料 液体医药(yyo)样品结果(ji gu)高效液相色谱柱可更换卡套可更换卡套色谱柱色谱柱Agilent 1100 高效液相系统溶剂溶剂以不同速率流出的组分色谱图色谱图高效液相系统和色谱柱高效液相系统和色谱柱第12页/共59页第十二页，共59页。气相气相

7、-质谱系统质谱系统(xtng)色谱色谱(s p)柱柱第13页/共59页第十三页，共59页。气相色谱系统气相色谱系统(xtng)检测器进样器色谱柱GAS 气源柱温箱数据处理第14页/共59页第十四页，共59页。食品食品(shpn)与香料与香料分析实例分析实例食品中的天然食品中的天然(tinrn)香精香精香料香料人工香精香料人工香精香料饮料中的醇类饮料中的醇类010203040Time (min.)奶酪胆固醇pepperoni 多肽蘑菇醛酸消化物样品(yngpn): 比萨色谱分析领域(1)第15页/共59页第十五页，共59页。生命科学生命科学奥运会医药工业FBI法医，法检0123(minutes)

8、气相色谱分析实例气相色谱分析实例体液体液(ty)和组织中的药品和组织中的药品血醇水平血醇水平药品纯度药品纯度色谱分析(s p fn x)领域(2)第16页/共59页第十六页，共59页。石化石化DB-1, 15 m x 0.25 mm I.D. 0.25 m filmStegosaurus-o-gram 航天汽油空气质量标准Pew!分析实例燃料油定级汽车(qch)排放的废气色谱分析(s p fn x)领域(3)第17页/共59页第十七页，共59页。环境环境DB-502.2105m x 0.53mm I.D., 30 m气相分析实例n水和土壤中的农残n饮用水中的溶解物 (MTBE甲基叔丁基醚 )n

9、 工业污染物n 新型持久性有机污染物（PCBs多氯联苯 , PFCs全氟有机物 ）色谱分析领域(4)第18页/共59页第十八页，共59页。Nam Laket in Tibat 纳木错湖PFCs第19页/共59页第十九页，共59页。Liver 180680ng/gBlood 2652 ng/gPlasma 2580 ng/mlPFCs第20页/共59页第二十页，共59页。 二、色谱法的几个重要(zhngyo)术语* 1. 色谱柱（column） 在茨威特实验中,装有CaCO3的玻璃管,即是一根色谱柱(是指包括CaCO3的管). 2. 固定相 (stationary phase) 在柱内固定不动的

10、一相称固定相,如CaCO3. 3. 流动相(mobile phase) 在柱内不断流动的一相,称流动相,如石油醚. 4. 被分离组分（样品） 如色素第21页/共59页第二十一页，共59页。 5. 洗脱 将流动相连续不断地加入色谱柱,使之通过固定相,把被分离的物质冲洗出柱的过程,叫洗脱。 洗脱是色谱过程中必要而又重要(zhngyo)的步骤选择适宜的流动相、固定相实现分离。 6. 洗脱剂 在洗脱过程中加入色谱柱的流动相即洗脱剂。 7. 洗脱液(流出液) 流出色谱柱的溶液,即洗脱液。第22页/共59页第二十二页，共59页。二、色谱法分类(fn li)（一）按流动相和固定相所处状态分类：气相色谱（GC

11、）：气体作为流动相液相色谱（LC）：液体作为流动相超临界流体色谱（SFC）：以超临界流体作为流动相（二）按分离机制分类： 1. 吸附色谱：以吸附剂作固定相，有机溶剂作为流动相，利用样品中不同组分在吸附剂上吸附能力的差别，而进行分离的方法(fngf)。 2. 分配色谱：根据组分在固定液与流动相中溶解度不同而分离。 3.空间排阻色谱：利用大小不同的分子在固定相（凝胶）与流动相中的选择渗透而达到分离的方法(fngf)。 4.离子交换色谱：利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而进行分离的方法(fngf)。 5.键合相色谱、毛细管电泳等第23页/共59页第二十三页，共59页。（三）按操作形式

12、分类： 1. 柱色谱：将固定相装在金属或玻璃色谱柱内或涂渍在柱内壁上而进行分离的方法。 2. 平面色谱： 1） 纸色谱：以滤纸为载体，以纸纤维吸附(xf)的水分为固定相，样品点在纸条一端，用流动相展开进行分离和分析的色谱法。 2） 薄层色谱：将吸附(xf)剂均匀地铺在玻璃板上形成薄层，分离方法同纸色谱。第24页/共59页第二十四页，共59页。(四） 按使用目的分类分析用：实验室、便携式；分析样品量少制备用：实验室用、工业用；纯物质制备，如高纯试剂、蛋白质、手性药物拆分和纯化流程(lichng)用：工业生产流程(lichng)在线连续使用第25页/共59页第二十五页，共59页。第二节第二节 色谱

13、色谱(s p)过程与术语过程与术语第26页/共59页第二十六页，共59页。 分离任何物质都要依据它们性质的差异。 例如蒸馏是利用沸点的差异，沉淀、结晶是利用溶解度不同。 在色谱(s p)当中，是利用物质在两相中溶解、亲和、吸附或其它亲和作用力的不同，使混合物中各组分达到了分离。 例如：分离含A、B两种组分的混合溶液。一、色谱分离(fnl)依据简介第27页/共59页第二十七页，共59页。 当组分进入柱后，由于组分与固定相间的亲合力，就要被固定相所滞留，即固定相对组分有滞留作用（保留作用），组分的性质不同，则固定相对不同组分的滞留能力(nngl)（保留能力(nngl)）不同。 组分与固定相之间的亲

14、合力越大，则固定相对该组分的滞留越强烈。它随流动相移动的速度就较慢；反之，组分在柱内的移动速度快；从而造成了A、B在柱内的差速迁移，即移动速度不同。 当经过一段距离后，速度的差异造成A、B组分先后出柱，得到分离。这就是色谱过程的本质。第28页/共59页第二十八页，共59页。 掌握的要点： （1）组分在柱内随流动相不断移动（溶解于流动相）。 （2）固定相与组分有亲合能力，即对组分有滞留能力（保留能力），使组分的速度低于流动相速度。 （3）性质(xngzh)不同的组分与固定相亲合力不同，固定相对其滞留能力（保留能力）不同，造成迁移速度不同（差速迁移）。 （4）经过一定柱长后，各组分因速度差异而分开

15、，即需要一定的柱长。第29页/共59页第二十九页，共59页。二、色谱流出曲线（色谱图）所谓色谱流出曲线，即流出液中的组分浓度随洗脱(x tu)体积或洗脱(x tu)时间的变化曲线，也称色谱图。第30页/共59页第三十页，共59页。 获得： （1）间隔一定(ydng)时间或一定(ydng)流出体积，测定流出液中组分的浓度，以浓度为纵坐标，时间或体积为横坐标，描点作图即得 （2）在柱子出口处设置检测器，如测定流出液的吸光度，换算成浓度（信号值），连续记录流出液的吸光度随时间的变化，即得色谱图（仪器化）。 流出曲线是柱内组分分离结果的反映，是研究色谱分离过程机理的依据，也是定性、定量的依据。 第31

16、页/共59页第三十一页，共59页。 色谱流出曲线的意义： 色谱峰数=样品中单组分的最少个数； 色谱保留值定性依据； 色谱峰高或面积定量依据； 色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价(pngji)指标； 色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。第32页/共59页第三十二页，共59页。三、几个重要的色谱参数(cnsh)及概念 （1）基线：在实验条件(tiojin)下，当只有流动相通过（检测器）色谱柱时，得到的流出曲线，通常为一水平直线称为基线。 （2）峰高（h）：从色谱峰到基线的垂直距离。 （3）峰宽（Wb）：从色谱峰的捌点作切线，与基线两交点之间的距离，也称基线宽度。 （4）半峰宽（W1/2

17、）：色谱峰高一半处峰的宽度（不是峰宽的一半） （5）标准偏差（）： 色谱峰两侧两捌点之间 的距离的一半，也即 0.607h处的峰宽的一半。第33页/共59页第三十三页，共59页。|W、W1/2色谱意义：| 它们反映被分离的组分分子在柱内迁移时的离散程度,W、W1/2越小，表示分子相对(xingdu)集中； W、W1/2 越大,表示分子相对(xingdu)分散。第34页/共59页第三十四页，共59页。 （6）拖尾因子T: 0.951.05，色谱(s p)峰为对称峰ABAAWTh2205. 0第35页/共59页第三十五页，共59页。 （7）保留(boli)时间(tR)（Retention time

18、） 流动相携带组分通过柱子所需要的时间，即从进样洗脱到流出液中组分的浓度出现极大值点所需要的时间。 （8）死时间(t0) 不被固定相所滞留的组分通过色谱柱所用的时间，即不被固定相所滞留的组分的保留(boli)时间，即死时间。 在时间上，它等于流动相分子通过色谱柱所需的时间，当某组分不被固定相所滞留时，即完全随流动相移动，其移动速度完全等于流动相的速度，所以t0=tm。第36页/共59页第三十六页，共59页。 （9）调整保留时间(tR)：扣除死时间后的组分实际被固定相所保留的时间,即tR= tR-t0 = tR-tm 意义(yy)： 组分随流动相移动的时间都是相同的，都是死时间。它与固定相、组分

19、的性质均无关，只与流动相的流动速度有关，对分离不起作用。 tR即为组分在固定相中出现的（保留的）时间，即组分被固定相所滞留的时间，与组分和固定相之间的作用力有关。 tR是与组分和固定相性质有关的，更能从本质上反映出不同组分的差异，反映色谱过程的实质。 第37页/共59页第三十七页，共59页。 （10）保留体积（VR） 从进样开始到组分洗脱出柱所用的洗脱剂的体积（与流速无关）。 （11）死体积（V0、Vm） 不被固定相滞留的组分的保留体积 (或不被固定相滞留的组分流出色谱(s p)柱所需要的洗脱剂的体积)。 这个体积应等于柱内流动相的体积，即流动相的量，也即固定相之间的空隙。 （12）调整保留体

20、积（VR） VR=VR - V0=VR - VM第38页/共59页第三十八页，共59页。 （13）相对保留值（2,1，2,1） 以一已知物的调整保留值为基准，其它各组分的调整保留值与之比值即为2,1，2,1。 2,1=tR 2/tR 1=VR 2/VR 1=2,1 须注意： 规定对于2,1须有tR 2tR1 VR 2VR 1 即2,11。 对于2,1, “1”表示基准物质, “2”表示待测物质,用于定性分析。 相对保留值只与固定相、组分及流动相的性质有关,与柱长、流速(li s)等无关。 若两组分能分离,则2,11 2,1又称为选择性因子第39页/共59页第三十九页，共59页。 （14）柱长(

21、L) 柱中填充(tinchng)固定相部分的长度。 第40页/共59页第四十页，共59页。要点： 需掌握tR、VR、t0 (tm)、tR、VR的色谱学意义及定义。 这些(zhxi)参数之间的关系，它们能说明什么问题? 第41页/共59页第四十一页，共59页。 思考题： 若一组分的分子通过色谱柱需tR时间，流动相分子通过色谱柱需用t0时间，问：该组分分子在色谱柱内有多少时间停留(tngli)在固定相上，有多少时间流动相中？第42页/共59页第四十二页，共59页。色谱法基本原理 p218 色谱(s p)分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由

22、组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱(s p)过程的热力学性质有关。 但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱(s p)柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱(s p)过程的动力学性质有关。 因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱(s p)行为。第43页/共59页第四十三页，共59页。一、色谱法分离过程(guchng)的动力学观点 所谓动力学观点是以分子的运动速度来考虑问题，研究(ynji)的是状态随时间的变化率。第44页/共59页第四十四页，共59页。1、组分在色谱(s p)柱内的移动速度（绝对速度）被分离的组分以一定的速度随流动相迁

23、移。当考虑一个分子时，它的迁移速度受两个因素影响：（1）被固定相滞留在固定相表面，分子停止前进，这时速度u组分=0。（2）溶解于流动相中，随流动相同速前进，这时u组分=um。所以组分分子在柱内的移动速度总是流动相在柱内的速度，即um 是极限速度。组分移动速度的大小，决定于固定相对组分的保留能力，即固定相与组分间作用力的大小。不同的组分，固定相对它的保留能力不同，其移动速度不同。设组分的移动速度为u组分（u组分=L/tR）， 即绝对速度，此速度受到流动相流速的影响，人们将两个组分的速度都与流动相相比较，就得保留速度第45页/共59页第四十五页，共59页。 2、保留(boli)因子（保留(boli

24、)比，retention factor、相对速度） 用R表示，即： R= u组分/ um 1 不同的组分的迁移速度不同，R不同，即固定相的保留(boli)能力不同（也称滞留因子）； R越小，则固定相对组分的保留(boli)能力越强。 将保留(boli)因子用色谱参数表示： R = u组分 / um = ( L / tR ) / ( L / tm ) = tm / tR = tm /（tm+tR）第46页/共59页第四十六页，共59页。 意义： 组分在色谱柱内有tm时间随流动相移动（u组分=um），有tR时间停在固定(gdng)相上（u组分=0），所以在色谱柱内的时间为tR+tm=tR 。 由此

25、可见，组分在色谱柱内的移动速度取决于tR，它直接反映出固定(gdng)相对组分的保留能力，tR不同，则u组分不同，即差速迁移，产生分离。 但是，从动力学观点，不能看出影响或决定不同组分迁移速度的因素，即固定(gdng)相对分子的保留能力无法定量地描述出来，于是人们提出了平衡的观点。 第47页/共59页第四十七页，共59页。二、色谱分离过程的平衡(pnghng)观点 平衡(pnghng)的观点不是以单一分子的个别运动状态来考虑问题，而是以某一时间内和空间内的整体，即某一区带的所有分子的行为来考察之。第48页/共59页第四十八页，共59页。 在色谱柱内很小的一段体积内（V），组分要在两相之间进行分

26、配，且迅速达到平衡，即从流动相进入固定(gdng)相的分子数等于从固定(gdng)相回到流动相的分子数（单位体积内），这时，（在一定温度下），组分在两相之间的浓度之比为一常数，我们称之为分配系数K。第49页/共59页第四十九页，共59页。1、 分配系数K 是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即 分配系数是由组分、固定相、流动相的热力学性质决定的，它是每一个溶质(rngzh)的特征值，它与固定相、流动相的性质和温度有关。与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。msCCK溶质在流动相中的浓度溶质在固定相中的浓度第50页/共59页第五十页，共59页。2、分配

27、比 （容量因子k） 又称容量因子，是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即 其中= Vm/ Vs (相比) k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离(fnl)组分保留能力的重要参数。 k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。KVVKVCVCmmmsmmssms k溶质在流动相中的量溶质在固定相中的量第51页/共59页第五十一页，共59页。注意三点： 分配比是组分在两相中的总量之比，而不是浓度之比，此量可以是重量数，也可以是摩尔

28、数等。 VS 系指真正参与组分在两相之间分配的那一部分有效体积，在不同的色谱体系中含义不同: 分配色谱指固定液的体积 吸附色谱吸附剂表面积 离子交换色谱交换剂的交换容量 凝胶色谱多孔固定相的孔容 分配系数与分配比的区别 分配系数只决定于组分和两相的性质，与两相体积无关，而分配比不仅(bjn)决定于其性质，且与两相体积有关，所有的组分的分配比均随固定相的量而变化。第52页/共59页第五十二页，共59页。3、K、k与组分迁移速度的关系 定性讨论：若组分的K大，则组分在固定相中分配的量多，即固定相对其保留能力强，移动速度应该(ynggi)慢；反之，保留能力弱。 定量讨论：K与保留时间的关系 因为 R

29、 = tm / tR = Nm / N总 Nm：流动相中组分的分子数； Ns：固定相中组分的分子数 ； N总：组分的分子总数 tm 占tR 的比例越大，则分子花在流动相中的时间比例越大，移动越快；即分子在流动相中停留的时间越多，则移动越快。 从分子总数来讨论：R = Nm / N总 组分在流动相中分子数占总分子数的比例越大，则组分移动越快，即组分在流动相中分子数越多，分子停留在流动相中的时间就越多。第53页/共59页第五十三页，共59页。所以 R = tm / tR = Nm / N总 = Nm / (Nm+Ns） = tm / (tm+ tR) = CmVm /（CmVm + CsVs） =

30、1 /（1+CsVs / CmVm） =1 /（1+KVs / Vm） =1 /（1+ k）所以 tR = tm（1+KVs /Vm） = tm（1+ k ） 保留方程所以 k= t R / tm若将 tR = tm（1+ k） = tm（1+KVs /Vm）两边统乘以流量（ml/min）（体积(tj)流量）则 VR = Vm（1+ k） = Vm+KVs 基本保留方程第54页/共59页第五十四页，共59页。4、保留方程讨论（1）K、k越大，tR 越大，组分移动速度越慢， 所以组分的迁移速度由组分的分配系数(比)决定。（2）K、k = 0时，组分不被固定相所滞留，此时(c sh) tR = tm ，即为非滞留组分； K、k时，tR，组分强烈滞留，