抗体的制备学习教案

1、会计学1抗体抗体(kngt)的制备的制备第一页，共82页。一、一些一、一些(yxi)基本概念基本概念 1. 克隆克隆(clone) 是指无性繁殖细胞是指无性繁殖细胞(xbo)系，是由单一个祖先系，是由单一个祖先细胞细胞(xbo)分裂繁殖而形成的一簇细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞(xbo)纯系。在这个家族的所有成员中，如无纯系。在这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因是完全相同的。突变发生，其基因是完全相同的。 细胞细胞(xbo)克隆：由一个细胞克隆：由一个细胞(xbo)增殖而增殖而成的细胞成的细胞(xbo)集团集团 第1页/共82页第二页，共82页。抗原抗原(kngyun)(antigen，

2、Ag)2. 抗原决定簇抗原决定簇 是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团基团(j tun)，又称表位，又称表位(epitope)，抗原结合，抗原结合位点位点Ag1234第2页/共82页第三页，共82页。 3.3.单克隆抗体单克隆抗体 (Monoclonal Antibody, McAb) (Monoclonal Antibody, McAb) 由一个识别一种抗原由一个识别一种抗原(kngyun)(kngyun)表表位的位的B B细胞克隆产生的同源抗体。细胞克隆产生的同源抗体。 4.4.多克隆抗体多克隆抗体 (Polyclonal Antibody (P

3、olyclonal Antibody，pAb)pAb) 用一种包含多种抗原用一种包含多种抗原(kngyun)(kngyun)决决定簇的抗原定簇的抗原(kngyun)(kngyun)免疫动物，可免疫动物，可刺激机体多个刺激机体多个B B细胞克隆产生针对多种细胞克隆产生针对多种抗原抗原(kngyun)(kngyun)表位的不同抗体。所表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。体的混合物。第3页/共82页第四页，共82页。Ag单克隆抗体单克隆抗体(kngt) (kngt) B1B2B3B4B3B3B3B32多克隆多克隆(k (k ln)ln)抗体抗

4、体341第4页/共82页第五页，共82页。第5页/共82页第六页，共82页。第6页/共82页第七页，共82页。第7页/共82页第八页，共82页。n 抗体的纯化、标记比单抗难n 因为含有各种不同(b tn)类型、亚类的抗体，n 提纯、标记的方法有所差别。同时，血n 清中含有的杂蛋白比较多。第8页/共82页第九页，共82页。FCM (Flow Cytometry,流式细流式细胞仪胞仪)ELISA(enzyme linked immunosorbent assey,酶联免疫吸附实验，酶联免酶联免疫吸附实验，酶联免疫分析疫分析)第9页/共82页第十页，共82页。 抗体的制备技术经历了三代(sn di)

5、：第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibody）；第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)；第三代(sn di)抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体(genetic engineering antibody)。第10页/共82页第十一页，共82页。抗体制备抗体制备(zhbi)(zhbi)技术技术一、多克隆抗体一、多克隆抗体(kngt)制备制备（一）免疫原的制备（一）免疫原的制备（二）免疫动物（二）免疫动物（三）免疫血清的纯化

6、（三）免疫血清的纯化（四）免疫血清的鉴定（四）免疫血清的鉴定（五）免疫血清的保存（五）免疫血清的保存二、单克隆抗体二、单克隆抗体(kngt)制备制备（一）单克隆抗体（一）单克隆抗体(kngt)制备原理制备原理第11页/共82页第十二页，共82页。（二）单克隆抗体制备的技术要点（二）单克隆抗体制备的技术要点（三）影响杂交瘤技术的因素（三）影响杂交瘤技术的因素（四）单克隆抗体的应用（四）单克隆抗体的应用三、基因工程三、基因工程(jyn gngchng)抗体技术抗体技术（一）人源化抗体（一）人源化抗体（二）小分子抗体（二）小分子抗体（三）双特异性抗体（三）双特异性抗体（四）抗体库技术（四）抗体库技术

7、抗体抗体(kngt)(kngt)制备技术制备技术第12页/共82页第十三页，共82页。二、多克隆二、多克隆(k ln)抗体制备抗体制备(一一)免疫原的制备免疫原的制备(zhbi)免疫原免疫原(immunogen)指能刺激机体免疫系统指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最重要的性质是免疫原性（最重要的性质是免疫原性（immunogenicity）免疫原免疫原天然抗原、人工合成抗原；天然抗原、人工合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原第13页/共82页第十四页，共82页。按按B处理处理(chl)。第14页/共82页第

8、十五页，共82页。第15页/共82页第十六页，共82页。第16页/共82页第十七页，共82页。过酶解将细胞间质消化，获得过酶解将细胞间质消化，获得游离单个细胞。游离单个细胞。第17页/共82页第十八页，共82页。对微生物的细胞作用较差。对微生物的细胞作用较差。第18页/共82页第十九页，共82页。第19页/共82页第二十页，共82页。条件下使细胞溶解。条件下使细胞溶解。第20页/共82页第二十一页，共82页。第21页/共82页第二十二页，共82页。第22页/共82页第二十三页，共82页。812%沉淀沉淀IgG，1215%沉淀其沉淀其它球蛋白，它球蛋白，25%则沉淀白蛋白。则沉淀白蛋白。第23页

9、/共82页第二十四页，共82页。 凝胶过滤凝胶过滤(gul)层析层析( 分子筛分子筛)的作用机理的作用机理第24页/共82页第二十五页，共82页。亲和层析的作用亲和层析的作用(zuyng)机理机理第25页/共82页第二十六页，共82页。第26页/共82页第二十七页，共82页。印迹印迹第27页/共82页第二十八页，共82页。纤维素，活性碳，乳酸等纤维素，活性碳，乳酸等第28页/共82页第二十九页，共82页。2. 连接方法：半抗原与载体的连接有物理连接方法：半抗原与载体的连接有物理法和化学法。法和化学法。物理法：用吸附法将载体与半抗原连接，物理法：用吸附法将载体与半抗原连接，其原理是通过电荷和微孔

10、来吸半抗原，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有吸附载体主要有PVP和和CMC等；等；化学法：利用某些化学法：利用某些(mu xi)功能基团把功能基团把半抗原连接到白质类或多肽类聚合物载半抗原连接到白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用不同的方法体上。不同的半抗原应选用不同的方法进行连接。进行连接。第29页/共82页第三十页，共82页。第30页/共82页第三十一页，共82页。第31页/共82页第三十二页，共82页。第32页/共82页第三十三页，共82页。第33页/共82页第三十四页，共82页。第34页/共82页第三十五页，共82页。第35页/共82页第三十六页，共82页。为

11、佳）；抗体需要量少时，选为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物用家兔、豚鼠和鸡等小动物(dngw)；抗体需要量大时，；抗体需要量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物大动物(dngw)。n抗原性质与动物抗原性质与动物(dngw)种类。种类。第36页/共82页第三十七页，共82页。第37页/共82页第三十八页，共82页。第38页/共82页第三十九页，共82页。第39页/共82页第四十页，共82页。1、基础免疫：首次抗原、基础免疫：首次抗原(kngyun)剂量剂量大，大， 300500g，用福氏完全佐剂。，用福氏完全佐剂。2、加强免疫：第、加强免疫：第2次以后

12、，抗原次以后，抗原(kngyun)量为首次剂量的量为首次剂量的1/41/2，用福氏不完全佐剂，每用福氏不完全佐剂，每24周加强免疫周加强免疫一次，多次。一次，多次。（三）免疫的基本（三）免疫的基本(jbn)步骤步骤第40页/共82页第四十一页，共82页。3、取血测效价：加强免疫两次或三次以、取血测效价：加强免疫两次或三次以后的第后的第7天取血。制备血清，检测天取血。制备血清，检测(jin c)抗体效价。如未达到预期效抗体效价。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时，为止。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。即可放血

13、制备抗血清。 第41页/共82页第四十二页，共82页。第42页/共82页第四十三页，共82页。图图1 颈动脉分离颈动脉分离(fnl)图图 第43页/共82页第四十四页，共82页。抗体抗体(kngt)反应反应 第44页/共82页第四十五页，共82页。第45页/共82页第四十六页，共82页。第46页/共82页第四十七页，共82页。(2)(2)双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。中央孔内加适量抗原中央孔内加适量

14、抗原( (容量为容量为50l)50l)，周围各，周围各孔内分别加入孔内分别加入50l 1:250l 1:2、1:41:4、1:81:8、1:161:16、1:321:32及不稀释的抗血清，及不稀释的抗血清，3737下孵育下孵育(f (f y)24hy)24h，观察有无沉淀线产生，以判断血清的，观察有无沉淀线产生，以判断血清的稀释度稀释度 第47页/共82页第四十八页，共82页。第48页/共82页第四十九页，共82页。第49页/共82页第五十页，共82页。第50页/共82页第五十一页，共82页。第51页/共82页第五十二页，共82页。第52页/共82页第五十三页，共82页。五、免疫血清的保存五、

15、免疫血清的保存(bocn) 1、4保存（保存（6个月）个月）2、低温保存（、低温保存（-70 -20 ，5年）年）3、真空干燥保存（、真空干燥保存（5 10年）年）注意点：保存前需经除菌注意点：保存前需经除菌 保存液含防腐剂保存液含防腐剂 避免反复避免反复(fnf)冻融（分装）冻融（分装） 第53页/共82页第五十四页，共82页。 单抗单抗 多抗多抗抗体组成抗体组成 单一单一 复杂复杂 抗体性质抗体性质 个体的属性个体的属性 群体群体(qnt)综合的性综合的性质质纯化标记纯化标记 容易，效果好容易，效果好 难度高一些难度高一些 种属来源种属来源 绝大多数是小鼠绝大多数是小鼠 兔子、羊、豚鼠等兔

16、子、羊、豚鼠等制备周期制备周期 长长 (最短最短4个月）个月） 短（短（2个月）个月）制备技术制备技术 复杂复杂 简单简单经费经费 多多 少少 第54页/共82页第五十五页，共82页。 一、杂交瘤技术一、杂交瘤技术(jsh)(jsh)的的原理及流程原理及流程第55页/共82页第五十六页，共82页。712周龄周龄(zhu ln)20g25g体重体重第56页/共82页第五十七页，共82页。初次初次(ch c)免疫：皮下多点注射或脾内注射，加福氏完全佐剂免疫：皮下多点注射或脾内注射，加福氏完全佐剂3W第二次免疫：皮下或腹腔内注射，加福氏不完全佐剂第二次免疫：皮下或腹腔内注射，加福氏不完全佐剂3W第三

17、次免疫：腹腔内注射，不加佐剂。第三次免疫：腹腔内注射，不加佐剂。采血测其效价采血测其效价57D加强免疫：腹腔内注射或静脉内注射加强免疫：腹腔内注射或静脉内注射23W3D取脾融合取脾融合第57页/共82页第五十八页，共82页。疫细胞对抗原的反应性。疫细胞对抗原的反应性。第58页/共82页第五十九页，共82页。第59页/共82页第六十页，共82页。最常用最常用(chn yn)骨髓瘤细胞系有：骨髓瘤细胞系有：NS1、SP20、X63 Ag8.653 第60页/共82页第六十一页，共82页。第61页/共82页第六十二页，共82页。第62页/共82页第六十三页，共82页。2104或或105细胞细胞/孔。

18、孔。巨噬细胞巨噬细胞第63页/共82页第六十四页，共82页。(2)制备免疫脾细胞制备免疫脾细胞(xbo)最后一次加强免疫最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死天后小鼠拉颈处死无菌取脾脏，培养液洗无菌取脾脏，培养液洗 一次一次脾脏研碎，过不锈钢筛网脾脏研碎，过不锈钢筛网离心，细胞离心，细胞(xbo)用培养液洗用培养液洗2次次计数计数取取108脾淋巴细胞脾淋巴细胞(xbo)悬液备用悬液备用 第64页/共82页第六十五页，共82页。，轻弹击离心管底，使细胞沉淀轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。略松动。第65页/共82页第六十六页，共82页。第66页/共82页第六十七页，共82页。聚乙二醇聚乙二醇PEG是

19、最常用的细胞融合剂是最常用的细胞融合剂。PEG可能的作用机理：可能的作用机理： PEG导致细胞膜上脂类物质结构重导致细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合。PEG的细胞融合作用完全是随机发生的细胞融合作用完全是随机发生的。一般的。一般(ybn)选用分子量选用分子量4000 的的PEG作为细胞融合剂。不同厂商、批号作为细胞融合剂。不同厂商、批号、分子量的、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不，其纯度与毒性有所不同。同。第67页/共82页第六十八页，共82页。H(Hypoxanthine, H)H(Hypoxanthine, H)次黄嘌呤；次黄嘌呤； A(Aminopterin)A(Aminopterin)氨基喋呤；氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断叶酸拮抗物，阻断(z dun)DNA(z dun)DNA合成主要合成主要途径途径 T(Thymidine, T)T(Thymidine, T)胸腺嘧啶核苷；胸腺嘧啶核苷；供细胞通过替代途径合成供细胞通过替代途径合成DNADNA。第68页/共82页第六十九页，共82页。骨髓瘤细胞缺乏胸