微生物多样性分析-堆肥

1、基于基于NGS研究微生物群落多样性研究微生物群落多样性主讲人：肖野主讲人：肖野主要内容 微生物多样性简介 微生物多样性研究方法综述 多样性测序案例环境微生物环境微生物微生物数量最多、范围最广微生物数量最多、范围最广元素循环与微生物相互作用元素循环与微生物相互作用 了解各系统中微生物的组成、掌握系统的能量代谢及发挥的功能至关重要了解各系统中微生物的组成、掌握系统的能量代谢及发挥的功能至关重要多样性研究手段发展史多样性研究手段发展史454(2005)Illumina(2006)Miseq(2011)19901960DGGET-RFLPClone libraryPacbio(2009)测序原理测序原

2、理454Miseq高通量研究多样性技术路线高通量研究多样性技术路线 DNA质检：检测DNA质量及浓度预实验：摸索PCR条件，尽量用最少的循环数扩增，减少PCR扩增对样品丰度的影响。同时将各个样品起始模板量均一化 正式实验：使用高保真酶，最大程度的减少PCR过程引入的碱基变化。每个样品经历3个批次的PCR扩增，降低偶然误差带来的影响。使用双barcode进行上机测序。 精确定量：精密仪器加上多年积累的经验，保证后期数据产出的均一性（我们的承诺）测序完要做哪些分析？测序完要做哪些分析？ 土壤土壤 建议土钻法，按“S”型选取6点土样，混合均匀后分装于封口试管中，液氮固定，-80保存。 水体水体 建议

3、采集底泥，或滤膜样本，混合均匀后分装于封口试管中，液氮固定，-80保存。常见问题如何取样如何取样常见问题样本量？样本量？横坐标：样品量；纵坐标：抽样后OTU数目。利用物种累积曲线可以作为对样品量是否充分的判断，曲线急剧上升表明样品量不足，需要增加抽样量；反之，则表明抽样充分，可以进行数据分析。Specaccum物种累积曲线物种累积曲线常见问题样品来源样品来源测序量测序量(细菌细菌)参考文献参考文献土壤1-2万pnas, 2013,110(16) 65486553.水样1万The ISME Journal (2013) 7,210220沉积物1万 Marine Pollution Bulleti

4、n 72 (2013) 181187测序量测序量稀释性曲线（稀释性曲线（Rarefaction curve）可变区可变区引物引物与与16S全长比对结果全长比对结果V1-V28F-338R高估高估V6967F-1046R高估高估V3338F-530R低估低估V71046F-1220R低估低估V7-V81046F-1392R低估低估V4530F-805R接近接近V5-V6805F-1046R接近接近V6-V7967F-1220R接近接近Youssef, N. et al. Comparison of species richness estimates obtained using nearly

5、complete fragments and simulated pyrosequencing-generated fragments in 16S rRNA gene-based environmental surveys. Applied and environmental microbiology 75, 52275236 (2009)该选取哪个测序区域？该选取哪个测序区域？常见问题Effects of nanoscale zero-valent iron particles on biological nitrogen and phosphorus removal and microo

6、rganisms in activated sludge 期刊名称：Journal of Hazardous Materials IF：9.267发表时间：2013不同浓度纳米粒子对活性污泥中微生物群落组成的影响不同浓度纳米粒子对活性污泥中微生物群落组成的影响测序平台：测序平台：454 pyrosequencing analysis测序区域：测序区域：16S V1V3 区取样：取样：活性污泥+50mL合成废水以及NZVI颗粒（后者浓度分别设为0，20，50和200mg/L，其中0作为对照），最终体积为200mL。实验设计实验设计NZVI颗粒对细菌群落组成的影响物种组成物种组成PCA结果高浓度N

7、ZVI处理组与对照组的微生物群落结构存在差异PCA分析分析多样性分析要回答的问题多样性分析要回答的问题v?单个物种（单个物种（singlespecies ）丰度在不同样品）丰度在不同样品中是否有差异中是否有差异?v 微生物群落结构（微生物群落结构（communitystructure）在）在不同组样品间是否有差异？不同组样品间是否有差异？v 某些环境因子（某些环境因子（environmentalvariables）是）是否能解释这些差异否能解释这些差异?单个物种丰度在不同样品中是否有差异?群落结构组分柱状图群落Heatmap图Venn图微生物群落结构在不同组样品间是否有差异？PCA分析NMDS

8、分析多样品比对树状图Cytoscape关联分析3D-PCoA分析单个物种丰度在不同样品中是否有显著差异?LEfSe分析Metastats分析宏基因组研究基因组基因组DNADNA高变区测序高变区测序功能注释及功能分类功能注释及功能分类基因预测基因预测代谢通路代谢通路比较基因组学分析比较基因组学分析串联组学串联组学物种分类物种分类物种丰度物种丰度系统进化系统进化 广义：广义：特定环境下所有生物遗传物质的总和。特定环境下所有生物遗传物质的总和。 狭义：狭义：生态环境中全部细菌和真菌基因组。生态环境中全部细菌和真菌基因组。宏基因组测序平台的选择环境样品基因组环境样品基因组DNA构建构建SE文库文库em

9、PCR454454测序测序片段化片段化方案2片段化片段化构建构建PE文库文库构建构建MPMP文库文库桥式桥式PCRMiSeq测序测序HiSeq测序测序方案1可选分析流程与策略组成分析组成分析差异分析差异分析关联分析关联分析网络分析网络分析进化分析进化分析Read-based metagenomeAssemble-based metagenome分析内容 COG注释注释KEGG GO注释注释Metagenomic Analysis of a Tropical Composting Operation at the Sao Paulo Zoo Park Reveals Diversity of B

10、iomass Degradation Functions and Organisms 期刊名称：Plos OneIF：9.267发表时间：2013不同时期堆肥微生物的变化及生物降解过程发挥的功能不同时期堆肥微生物的变化及生物降解过程发挥的功能 样品选择：样品选择： Sao Paulo Zoo Park composting facility ZC1样品采自堆肥开始的第8天，65.8，pH 7.0 ZC2样品采自堆肥开始的第60天，67.2，pH 7.0 测序平台：测序平台： Roche 454 GS FLX实验设计实验设计 ZC1样品中含量最丰富的门是Proteobacteria ZC2样品中含量最丰富的门是Firmicutes物种组成物种组成 物种组成物种组成 样品ZC1和ZC2中片段所注释到的COG功能相似，但是样品ZC1降解纤维素的能力要比样品ZC2强。COG注释注释 白腐真菌和褐腐真菌是降解木质素的主要菌群，但是也发现了一些细菌也可以降解木质素。 在样品ZC1和ZC2中，发现木质素降解基因-Dyp-type氧化物酶基因，NCBI比对后发现两个不同样品中获得的Dyp-type氧化物酶基因是全长基因。木质素降解基因木质素降解基因 堆肥在不同发酵阶段群落组成； 在堆肥过程中，虽然主要的群落组成发生了改变，但是整个群落所行使的功能并未发生很大的改