蛋白质的复性2

1、蛋白质的复性蛋白质的复性包含体包含体什么是包含体？什么是包含体？ 包含体是指外源基因在宿主细胞中表达时，表达包含体是指外源基因在宿主细胞中表达时，表达的蛋白质不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内的蛋白质不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集聚集成成没有生物活性没有生物活性的直径约的直径约0.1-3.0m0.1-3.0m的固体的固体颗粒。这些基因表达产物的颗粒。这些基因表达产物的一级结构一级结构( (即氨基酸即氨基酸序列序列) )虽然虽然正确正确，但其，但其立体结构是错误的立体结构是错误的。 一般认为包含体的形成是一般认为包含体的形成是蛋白质过量表达蛋白质过量表达的结的结果。果。包含体的形成是部分

2、折叠的中间态之间包含体的形成是部分折叠的中间态之间疏水性疏水性相互作用相互作用的结果，主要原因是蛋白质本身具有易于的结果，主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉淀的性质，或表达产物周围的物理环境（如温聚集沉淀的性质，或表达产物周围的物理环境（如温度、离子组成）不适或缺少某些折叠辅助因子（如分度、离子组成）不适或缺少某些折叠辅助因子（如分子伴侣）的作用。子伴侣）的作用。其形成是不可预测的。其形成是不可预测的。包含体的性质包含体的性质 高密度的蛋白质聚集体高密度的蛋白质聚集体 主要为基因表达产物主要为基因表达产物 包含体内的表达产物具有部分二级结构包含体内的表达产物具有部分二级结构 包含体对蛋白酶解不

3、敏感包含体对蛋白酶解不敏感以包含体形式表达重组蛋白质具有优势：以包含体形式表达重组蛋白质具有优势：书书386386页页蛋白质复性蛋白质复性n 利用高浓度的强变性剂溶解包含体，如利用高浓度的强变性剂溶解包含体，如6-6-8mol/L8mol/L盐酸胍或盐酸胍或8mol/L8mol/L尿素，也可利用硫尿素，也可利用硫氰酸盐或表面活性剂。氰酸盐或表面活性剂。n对于含有二硫键的蛋白质，还需加入还原对于含有二硫键的蛋白质，还需加入还原剂解离错配的二硫键剂解离错配的二硫键n螯合剂清除重金属离子螯合剂清除重金属离子蛋白质复性稀释复性分子伴侣辅助复性反胶束复性固相辅助复性 稀释复性：直接稀释复性直接稀释复性透

4、析复性透析复性流加复性流加复性 蛋白质复性复性的影响因素 浓度 增加蛋白质的浓度有利于聚集的进行增加蛋白质的浓度有利于聚集的进行 温度 蛋白质的复性一般在室温下进行，温度过高（蛋白质的复性一般在室温下进行，温度过高（40） 蛋白质的聚集将十分严重蛋白质的聚集将十分严重 pH值 通常复性在弱碱性条件下（通常复性在弱碱性条件下（pH8）进行，但要注意避免）进行，但要注意避免 与蛋白的与蛋白的pI值相近值相近 折叠促进剂 （辅助因子） L-Arg, PEG, 去污剂去污剂, 尿素和盐酸胍尿素和盐酸胍包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）分子伴侣辅助分子伴侣辅

5、助复性复性分子伴侣分子伴侣1978年Laskey等发现；1987年Ellis提出普遍意义分子伴侣；1993年Ellis对分子伴侣做了更为确切的定义：即分子伴侣是一类相互之间有关系的即分子伴侣是一类相互之间有关系的蛋白蛋白，它们的功能是帮助其他含多肽结构，它们的功能是帮助其他含多肽结构的物质在体内进行的物质在体内进行正确的正确的非共价非共价的组装，的组装，并且不是组装完成的结构在发挥其正常的并且不是组装完成的结构在发挥其正常的生物功能时的组成部分。生物功能时的组成部分。 分子伴侣在蛋白质正确折叠中的关键作用分子伴侣在蛋白质正确折叠中的关键作用阻碍集聚阻碍集聚折叠互补功能折叠互补功能促进错误折叠降解促进错误折叠降解反胶团中的蛋白质复性 利用反胶团溶解变性蛋白质，可将变性蛋白质分利用反胶团溶解变性蛋白质，可将变性蛋白质分子彼此分隔开来，阻止分子间的相互作用，提高子彼此分隔开来，阻止分子间的相互作用，提高复性收率。复性收率。 存在问题：变性剂抑制蛋白质在反胶团相的溶解存在问题：变性剂抑制蛋白质在反胶团相的溶解，故萃取率很低。，故萃取率很低。展展 望望 研究蛋白质变性复性机理，开发新的变性研究蛋白质变性复性机理，开发新的变性复性原理和技术，解决目前的技术关键。复性原理和技术，解决目前的技术关键。