叶绿素荧光测量--OSP

1、澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰北京澳作生态仪器有限公司技术部 苌伟2008.12.23澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰一、叶绿素荧光产生的原理一、叶绿素荧光产生的原理二、叶绿素荧光测量模式二、叶绿素荧光测量模式三、叶绿素荧光技术的应用三、叶绿素荧光技术的应用四、调制时荧光仪的操作四、调制时荧光仪的操作五、日常维护五、日常维护澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰叶绿素荧光产生的原理叶绿素荧光产生的原理澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰光合作用的过程光合作用的过程光能光能CO2色素分子色素分子C52C3ADP+PiATPH2OO2H多种酶多种酶酶酶吸收吸

2、收光解光解光反应阶段暗反应阶段暗反应阶段水的光解水的光解：H2O 2H+1/2 O2 光解CO2的固定的固定: CO2+C5 2C3酶还还 原原酶酶固固 定定供能供能（CH2O）酶酶 C3化合物还原化合物还原：2 C3 （CH2O）6 ATP酶H,ADP+Pi光合磷酸化光合磷酸化：ADP+Pi能量 ATP酶澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰光合单位光合膜上能进行完整光反应的最小结构单位光合膜上能进行完整光反应的最小结构单位澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰图图 光合作用过程中能量运转的基本概念光合作用过程中能量运转的基本概念 通过上述色素分子间的能量传递，聚光色素吸通过上述

3、色素分子间的能量传递，聚光色素吸收的光能会很快到达并激发反应中心色素分子，启收的光能会很快到达并激发反应中心色素分子，启动光化学反应。动光化学反应。澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰 当一个叶绿素分子当一个叶绿素分子a a的电子从激发态的电子从激发态1 1到基态的去到基态的去激化过程中，一小部分激发能（激化过程中，一小部分激发能（3-9%3-9%）耗散为红色的）耗散为红色的荧光。其它去激化过程包括热、将能量传递给其它色荧光。其它去激化过程包括热、将能量传递给其它色素分子及光化学反应、从三线态到基态的磷光发射。素分子及光化学反应、从三线态到基

4、态的磷光发射。红红光光兰兰光光热热热热荧荧光光磷磷光光基态基态第一激发态第一激发态第二激发态第二激发态传递给其它色素传递给其它色素及光化学反应及光化学反应三线态三线态植物细胞中的叶绿素分子澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰激发态的命运激发态的命运澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰什么是调制技术n所谓调制技术，就是说用于激发荧光的测量光measuring light (调制光modulation light)具有一定的调制（开/关）频率，检测器只记录与测量光同频的荧光，因此调制荧光仪允许测量所有生理状态下的荧光，消除了背景光的影响。正是由于调制技术的出现，才使得叶绿素荧光由传

5、统的“黑匣子”测量（避免环境光的黑暗测量）走向了野外环境光下测量，叶绿素荧光的研究由生理学走向了生态学。澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰什么是饱和脉冲技术 n所谓饱和脉冲技术，就是打开一个持续时间很短（一般小于1 s）的强光，使所有的电子受体都处于关闭状态（光合作用被暂时抑制），从而使叶绿素荧光达到最大。n饱和脉冲（Saturation Pulse, SP）可被看作是光化光（actinic light）的一个特例。光化光越强，PS II释放的电子越多，PQ处累积的电子越多，也就是说关闭态的电子受体越多，F越高。n当光化光达到使所有的电子受体都关闭（不能进行光合作用）的强度时，就称之

6、为饱和脉冲。打开饱和脉冲时，本来处于开放态的电子受体将该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热，F达到最大值。 澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰调制式荧光仪工作原理图调制式荧光仪工作原理图123456781：调制测量光；：调制测量光；2：活化光；：活化光；3：饱和强光脉冲；：饱和强光脉冲；4：远红光；：远红光；5：检测器及放大器；：检测器及放大器；6：短波通过滤光片；：短波通过滤光片；7：长波通过滤光片；：长波通过滤光片；8：样品：样品 调制式荧光仪测量叶绿素荧光原理：弱测量光，通过相位和频率的解调制式荧光仪测量叶绿素荧光原理：弱测量光，通过相位和频率的解码方式将弱光导致的荧光变

7、化从连续光诱导的荧光产量中分离出来码方式将弱光导致的荧光变化从连续光诱导的荧光产量中分离出来（ ScreiberScreiber 1986 1986等）。等）。澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰 采用脉冲调制式方法（采用脉冲调制式方法（Quick and Horton, 1984Quick and Horton, 1984），），可以在全光照情况下测量叶绿素荧光信号，而不必被未可以在全光照情况下测量叶绿素荧光信号，而不必被未过滤的活化光所干扰。用过滤的活化光所干扰。用LEDsLEDs产生重复性脉冲并用短波产生重复性脉冲并用短波长滤光片过滤，光电二极管被长波长的滤光片保护。高长滤光片过

8、滤，光电二极管被长波长的滤光片保护。高选择性脉冲放大器可以忽略其它信号而只保留脉冲过程选择性脉冲放大器可以忽略其它信号而只保留脉冲过程中所产生的荧光。这样整个测量系统就可以忍受活化光中所产生的荧光。这样整个测量系统就可以忍受活化光密度的高度变化。密度的高度变化。 调制式荧光仪的优点调制式荧光仪的优点 光化学反应过程、非光化学反应过程、光合系统光化学反应过程、非光化学反应过程、光合系统的保护机制、光合系统的调节机制、的保护机制、光合系统的调节机制、PSIIPSII的受损状况的受损状况等等方面可以从调制式荧光仪测量过程中推知出来等等方面可以从调制式荧光仪测量过程中推知出来。澳作公司澳作公司EcoT

9、ech 易科泰易科泰 叶片暗适应叶片暗适应2020分钟，加上饱和强光脉冲（如分钟，加上饱和强光脉冲（如8000mol m8000mol m-2-2s s- -1 10.80.8秒），荧光从基线（秒），荧光从基线（F F0 0）上升到最大值上升到最大值F FM M。在这种情况下，在这种情况下，光系统光系统2 2的初级电子受体的初级电子受体Q QA A完全被还原。于是可以测定光系统完全被还原。于是可以测定光系统2 2原原初光化学反应的最大量子效率初光化学反应的最大量子效率F FV V/F/FM M。 随后加上连续光（也称活化光随后加上连续光（也称活化光actinic lightactinic li

10、ght），），荧光产量荧光产量瞬态上升，这之后，由于光化学过程和热耗散过程的发生，荧瞬态上升，这之后，由于光化学过程和热耗散过程的发生，荧光产量产生淬灭到一个稳态数值（光产量产生淬灭到一个稳态数值（FtFt）。）。在活化光存在的情况在活化光存在的情况下加上饱和光脉冲，荧光产量达到一个极大值（下加上饱和光脉冲，荧光产量达到一个极大值（F FM M），），但比但比暗中最大值要小（暗中最大值要小（F FM M）。）。在测量在测量F FM M时时Q QA A再次被完全还原，因此，再次被完全还原，因此，F FM M与与FtFt之间的差值反映了荧光产量淬灭的光化学组分，之间的差值反映了荧光产量淬灭的光化学

11、组分，F FM M 与与F FM M 之间的差值反映了荧光产量淬灭的热耗散组分。之间的差值反映了荧光产量淬灭的热耗散组分。 需要测定测量时需要测定测量时F F0 0的数值，一般采用的方法是对叶片进行的数值，一般采用的方法是对叶片进行暗适应或加上远红光（波长大于暗适应或加上远红光（波长大于680nm680nm）数秒钟，后者使数秒钟，后者使PSIIPSII反反应中心快速打开。应中心快速打开。 使用调制式荧光仪测量叶绿素荧光过程使用调制式荧光仪测量叶绿素荧光过程澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰部分慢速荧光参数及其生物学意义部分慢速荧光参数及其生物学意义参数参数生物学意义生物学意义FV/F

12、M光系统光系统2原初光化学反应的最大光化学效率原初光化学反应的最大光化学效率 qP光化学淬灭，反映了光系统光化学淬灭，反映了光系统2的初级电子受体的初级电子受体QA的还原状态，的还原状态，或称开放的或称开放的PSII中心的比例；中心的比例； qN非光化学淬灭，反映了与类囊体膜能量化相关的耗散热能变非光化学淬灭，反映了与类囊体膜能量化相关的耗散热能变化化 ;q0最小荧光相对变化，与电子流调节、最小荧光相对变化，与电子流调节、PS2失活、色素复合物失活、色素复合物的构相变化相关；的构相变化相关； P有效量子产率，开放的有效量子产率，开放的PS2中心捕能效率；中心捕能效率； 2能量转换的有效量子产率

13、，电子传递的量子产率；能量转换的有效量子产率，电子传递的量子产率；NPQ反映了与类囊体膜能量化相关的耗散热能变化反映了与类囊体膜能量化相关的耗散热能变化 ;ETR有效电子传递速率；有效电子传递速率；Rfd叶绿素荧光降低比例，植物活力指标之一叶绿素荧光降低比例，植物活力指标之一澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰部分慢速荧光参数的计算方法部分慢速荧光参数的计算方法F0F0FVFVFM-FsFV-FV;FM-FMqP = (F= (FM M Fs)/Fv Fs)/Fv qN = (FV-FV)/FV q0 = (F0-F0)/F0P=FV/FM2 =(FM-Fs)/FM=qP P NPQ

14、= (FM-FM)/ FM ETR=PFD 2 f1f2Rfd=(Fp-Fs)/Fsf1:两个光系统之间的光能分配系数，一般设为两个光系统之间的光能分配系数，一般设为0.5;f2:叶片吸收光能系数，一般设为叶片吸收光能系数，一般设为0.85PFD:光辐射通量光辐射通量澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰OS5p调制型叶绿素荧光仪的调制型叶绿素荧光仪的4种测量模式种测量模式澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰Fv/Fm模式 n叶绿素经过充分暗适应后，所有电子受体均处于开放状态，打开测量光得到初始荧光Fo，然后给出一个饱和脉冲，所有的电子受体就都将该用于光合作用的能量转化为了荧光和

15、热，此时得到的叶绿素荧光为最大荧光Fm。n根据Fm和Fo可以计算出PS II的最大量子产量Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，它反映了植物的潜在最大光合能力。 澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰Yield模式 n在光照下植物正常进行光合作用时，只有部分电子受体处于开放状态。如果给出一个饱和脉冲，本来处于开放态的电子受体将该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热，此时得到的叶绿素荧光为Fm。n根据Fm和F可以求出在当前的光照状态下PS II的实际光量子产量Yield=PSII=F/Fm=(Fm-F)/Fm，它反映了植物目前的实际光合效率。 澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰K

16、inetic模式 n在光照下光合作用进行时，只有部分电子受体处于关闭态，实时荧光F比Fm要低，也就是说发生了荧光淬灭（quenching）。n植物吸收的光能只有3条去路：光合作用、叶绿素荧光和热。根据能量守恒：1光合作用叶绿素荧光热。可以得出：叶绿素荧光1光合作用热。也就是说，叶绿素荧光产量的下降（淬灭）有可能是由光合作用的增加或热耗散的增加引起的。 澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰由光合作用的引起的荧光淬灭称之为光化学淬灭（photochemical quenching, qP）；由热耗散引起的荧光淬灭称之为非光化学淬灭（non-photochemical quenching,

17、qN或NPQ）。光化学淬灭反映了植物光合活性的高低；非光化学淬灭反映了植物耗散过剩光能为热的能力，也就是光保护能力。澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰OJIP模式荧光动力学曲线n将绿色植物或含有叶绿素的部分组织进行暗适应后，突然暴露在可见光下，就会观察到，叶绿素会发出一种暗红色、强度随时间不断变化的荧光信号，以荧光信号做出的曲线称为叶绿素荧光诱导曲线。这个过程最早是由Kautsky发现的，因此也称为Kautsky效应。n植物发出的荧光信号随时间的变化而变化，从暗适应到暴露在光下，荧光信号先上升，然后下降。一般情况下，刚暴露在光下时的最低荧光定义为O点，而荧光的最高峰定义为P点，从O点

18、到P点并不是平滑上升的曲线，而是有几个拐点（J点、I点）。n快速叶绿素荧光诱导曲线指的就是从O点到P点的荧光变化过程，主要与PS的原初光化学反应有关（Krause和Weis 1991, Strasser等1995, 2000, 2004），而下降的阶段主要与碳代谢有关（Krause和Weis 1991）。澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰叶绿素荧光技术的应用叶绿素荧光技术的应用澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰案例分析一案例分析一不同发育时期冬小麦旗叶的荧光特性研究不同发育时期冬小麦旗叶的荧光特性研究研究目的研究目的:不同发育时期冬小麦旗叶的荧光和光合特性不同发育时期冬小麦

19、旗叶的荧光和光合特性,为选育优良品种提为选育优良品种提供依据供依据研究结果研究结果: 随着小麦从扬花期到乳熟期的生长随着小麦从扬花期到乳熟期的生长,旗叶的光系统旗叶的光系统最大光量子最大光量子效率效率(/)变化不大变化不大,在乳熟期略有下降在乳熟期略有下降,光化学淬灭光化学淬灭(),光系统光系统量子产率量子产率()和有较大的降低和有较大的降低(15%),非光化学淬灭非光化学淬灭()则有明显的增大则有明显的增大(100%),旗叶的旗叶的与存在线性关系与存在线性关系(=0.918)。说明了在不同小麦品种中生长的衰老使得旗叶光合作用从能量。说明了在不同小麦品种中生长的衰老使得旗叶光合作用从能量转化到

20、二氧化碳同化速率都显著降低。转化到二氧化碳同化速率都显著降低。澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰案例分析二案例分析二光胁迫下杂种杨无性系光合生理生态特性的比较光胁迫下杂种杨无性系光合生理生态特性的比较研究目的研究目的:探讨不同杨树无性系对光胁迫的适应策略探讨不同杨树无性系对光胁迫的适应策略研究结果研究结果:中午强光导致的二氧化碳同化下降的原因之一是光合系统受损中午强光导致的二氧化碳同化下降的原因之一是光合系统受损,这是从叶绿素荧光测定的参数所推知的这是从叶绿素荧光测定的参数所推知的,各无性系发生光抑制的可能性也各无性系发生光抑制的可能性也可以从测定参数计算出来并与气体交换数据符合可以

21、从测定参数计算出来并与气体交换数据符合.澳作公司澳作公司EcoTech 易科泰易科泰案例分析三案例分析三珊瑚树和大豆叶片叶绿素荧光的非光化学猝灭珊瑚树和大豆叶片叶绿素荧光的非光化学猝灭研究目的研究目的: (1)在自然条件下在自然条件下,在中是否起重要作用在中是否起重要作用;(2)在不同种在不同种的植物叶片中的植物叶片中,及其及其3个组分的日变化是否遵循同一方式个组分的日变化是否遵循同一方式;(3)的慢的慢组分是否主要地与叶黄素循环有关。组分是否主要地与叶黄素循环有关。研究结果研究结果:非光化学猝灭快、中和慢非光化学猝灭快、中和慢3个组分个组分(,与与)和和505光吸收的日变化。主要结果如下光吸收的日变化。主要结果如下:(1)中午中午,珊瑚树叶片的比珊瑚树叶片的比大得多大得多,而大豆叶片的这两个参数却几乎处于同一水平。它们的而大豆叶片的这两个参数却几乎处于同一水平。它们的虽然也随光强变化虽然也随光强变化,但与和相比但与和相比,除早晨和傍晚以外全天除早晨和傍晚以外全天的水平都是最低的。的水平都是最低的。(2)珊瑚树叶片的初始荧光水平珊瑚树叶片的初始荧光水平()中午最低中午最低,而大豆而大豆叶片的中午最高。叶片的中午最高。(3)饱和光照射引起的珊瑚树叶片饱和光照射引起的珊瑚树叶片505光吸收的光吸收的增加比大豆叶片大得多。增加