近红外激光诱导纳米金壳选择性热疗对人宫颈癌Caski细胞抑

1、 基金项目: 国家863计划资助项目（2007AA021804）Supported by the State 863 projects of China (2007AA021804)作者简介:曲华伟（1979-）,男,山东省青州市人,汉族，博士研究生,主治医师,发表论文10篇，主要从事肝胆外科的基础及临床方面的研究。Tel :013574150797 E-mail: 通信作者:张阳德,电话:(0731) 4327036近红外激光诱导纳米金壳选择性热疗对人宫颈癌Caski细胞抑制作用的实验研究曲华伟 何剪太 王吉伟 曾庆仁 赵劲风 张阳德【摘要】 目的 通过近红外激光诱导下纳米金壳产热对人宫颈癌

2、Caski细胞的体内体外实验研究，评估该项技术的可行性。 方法 首先对与人宫颈癌Caski细胞共同培养纳米金壳进行近红外激光照射；再对裸鼠肿瘤模型进行近红外激光诱导照射。通过针对宫颈癌细胞的体内体外试验，观察肿瘤细胞的形态变化，肿瘤模型的病理变化以及肿瘤体积质量的变化等，从而分析该疗法的可行性和效果。 结果 体内体外实验表明，宫颈癌Caski细胞增值明显受抑制，肿瘤内部出现大量坏死，质量体积明显减小。 结论 选择性近红外激光诱导纳米金壳热疗可以明显抑制人宫颈癌Caski细胞的增值，可使宫颈癌肿瘤模型体积减小，可作为宫颈癌治疗的一种有效方法。【关键词】纳米金壳 ；近红外激光 ；宫颈癌 。Sele

3、ctive cervical carcinoma thermal ablation with laser activated gold nanoshells in LaboratoryQU Hua-wei，HE Jian-tai，WANG Ji-wei，ZENG Qing-ren，ZHAO Jin-feng，ZHANG Yang-de, （National Hepatobiliary Enteric Surgery Research Center of South University，Changsha 410008，China）Abstract Objective To study the

4、therapeutic effect of near-infrared mediated nanoshell hyperthermia on human Caski cells of cervical carcinoma in vitro and in vivo. Methods By in vitro and in vivo experiments，the morphologic changes of cells and the pathological changes of tumour models were observed . We can estimate the effect o

5、f the treatment. Results Near-infrared mediated gold nanoshell hyperthermia could significantly inhibit the proliferation of Caski cells , . Animal experiment showed that it could significantly inhibit the weight and volume of cervical carcinoma. Conclusion Near-infrared mediated gold nanoshell hype

6、rthermia could inhibit the proliferation of human Caski cells and the weight and volume of cervical carcinoma. It could open up a new treatment of cervical carcinoma.Keywords ：Gold nanoshell；Near-infrared light ；Carcinoma.宫颈癌是女性生殖系统发病率最高的恶性肿瘤 ,近年来发病率呈上升和年轻化的趋势。进展期及复发性宫颈癌的治疗疗效不佳，肿瘤热疗学近年来重新得到关注和研究1。热疗

7、是用人工加热的方法治疗恶性肿瘤，达到杀灭癌细胞避免正常细胞遭受损伤的目的。传统热疗受其高温对周围正常组织的毒性反应的影响，多采用亚高温热疗（39.541.5），温度相对较低，对肿瘤的杀伤作用有限2。因此，研究探索新的热疗方法具有重要意义。近年来，随着纳米生物技术的发展，在纳米水平上研制出的一系列纳米产热材料引起了人们的广泛兴趣。纳米金壳就是其中一种。它是用金包覆二氧化硅纳米颗粒而制备的一种新型纳米材料，其特点是表面受光照射时，表面的电子被激发到高能级，与光波的电场耦合产生共振，将光能转化为热能，从而产热。基于这个特点，2003年美国Hirsch教授3研制出纳米金壳材料，通过近红外激光诱导照射下

8、热疗治疗肿瘤取得了一定进展。我们运用自制的纳米金壳材料，通过近红外激光诱导照射下产热对人宫颈癌Caski细胞进行体内外的实验研究，旨在为新的有效的热疗治疗宫颈癌的途径提供理论依据。材料和方法1.主要试剂：纳米金壳由中国科学院理化技术研究所提供。2.细胞培养：人宫颈癌Caski细胞购自中南大学肿瘤研究所。培养条件：含 10% 小牛血清的RPMI 1640 培养液， 37、5%CO2孵箱内培养。3.实验动物: SPF级BALB/N裸鼠42只 ,68 周龄,体重 20g-22g, 由中南大学动物学部提供。4.金壳升温实验：将纳米金壳稀释成不同浓度，各取2ml加入10ml试管，激光发射器距离试管壁约0

9、.5cm，输出电流2.5A，照射10min，绘制纳米金壳的温度升高曲线。5. 细胞生长抑制实验：（1）细胞形态观察：细胞贴壁生长48h，对照组加入5ml1.25mg/ml 纳米金壳，热疗组分别加入0.25、0.40、0.55、0.70mg/ml纳米金壳各5ml，热疗组分别在（输出电流2.5安培）近红外激光照射10min；继续培养24h，倒置显微镜下拍照。（2）细胞活力检测：取1104个细胞分别接种在96孔培养板中，培养48小时后分别加入0.25、0.40、0.55、0.70mg/ml的纳米金壳100l，近红外激光照射10min，进行MTT实验。酶标仪在490nm波长测吸光度值。6.裸鼠荷瘤实验

10、：成功接种人宫颈癌裸鼠42只，当肿瘤长至0.5cm时随机分为对照组、纳米金壳非照射组、无纳米金壳纯照射组、0.25、0.40、0.55、0.70gL纳米金壳热疗组计等7组，每组6只，尾静脉注射金壳溶液（对照组注射生理盐水）. 48小时后近红外激光照射10分钟，每隔三天照射一次，观察裸鼠及肿瘤的生长情况，8周后结束。测量肿瘤体积与质量。观察肿瘤体积变化差异. 7移植宫颈癌肿瘤组织切片观察：苏木素-伊红染色观察正常与热疗组移植瘤组织的病理变化。 8.统计学方法：实验结果采用统计软件SAS6.12及SPSS10.0统计软件包进行t检验。结果1.纳米金壳加热试验：不同浓度纳米金壳在近红外激光照射下（输

11、出电流2.5安培），可升温至3549，且在照射前4min升温迅速，410min升温平缓。2.金壳热疗对宫颈癌细胞形态的影响：对照组细胞（图1A）形态规则，分布均匀，未见明显细胞坏死。热疗组（图1B）细胞变形、坏死，细胞贴壁减少，可见较多沉积的纳米金壳材料。 A:正常肝癌HegG2细胞 B:肝癌HegG2细胞激光照射后 图1：纳米金壳热疗对肝癌HegG2细胞形态的影响（倒置显微镜100）3.纳米金壳热疗对宫颈癌细胞增殖的影响：纳米金壳热疗对宫颈癌细胞增殖有显著的抑制作用，且其抑制作用与纳米金壳浓度有剂量依赖关系，最大抑制率达82%。热疗组与对照组相比差异有统计学意义（P0.05）（见表1）。表1

12、 不同浓度纳米金壳热疗对Caski细胞作用的MTT结果（ EQ Xto(X) s）组别0.25g/l金壳0.40g/l金壳0.55g/l金壳0.70g/l金壳对照组OD1金壳照射组OD2无金壳仅照射组OD3增殖率（%）抑制率（%）0.6120.0230.2120.011*0.6350.01634.665.40.6040.0160.2040.014*0.5990.02533.766.30.6220.0100.1740.018*0.6280.00927.972.10.5880.0120.1060.014*0.6080.01018.082.0注：与对照组比较，*P0.05，P0.05.增殖率（%）=

13、OD2OD1100%，抑制率1-OD2OD1100%4. 裸鼠荷瘤实验结果：热疗组移植瘤体积缩小，肿瘤表面不光滑，可见坏死及焦痂形成。对照组移植瘤体积逐渐增大，表面光滑，未见坏死组织。（图2）纳米金壳照射组与纳米金壳非照射组，无纳米金壳纯照射组及对照组相比其肿瘤体积和质量差异均有统计学意义（P0.05）。照射组肿瘤的体积抑制率分别为55.83%、77.04%、93.00%、97.93%，质量抑制率分别为37.23%、59.04%、74.20%、88.38%。（见表2）表2 不同浓度纳米金壳热疗对裸鼠移植瘤质量与体积的抑制作用（ EQ Xto(X) s）组别肿瘤质量（g）肿瘤体积（mm3）肿瘤质

14、量抑制率（%）肿瘤体积抑制率（%）对照组金壳非照射组无金壳照射组0.25g/l照射组0.40g/l照射组0.55g/l照射组0.70g/l照射组0.65510.03290.63430.02110.63480.01920.41120.0322*0.26830.0295*0.16900.0175*0.07610.0174*321.2595.31317.1290.50310.1197.45141.9150.15*73.7417.83*22.477.33*6.642.25*3.173.0937.2359.0474.2088.381.283.4655.8377.0493.0097.93注：与对照组比较，

15、*P0.05，P0.05，P0.05；与非照射组比较，*P0.05；与无金壳照射组比较，*P0.05. A:正常裸鼠成瘤模型 B:尾静脉注射金壳后 C: 激光照射后肿瘤体积明显缩小近红外激光照射肿瘤 图2：裸鼠荷瘤实验（裸鼠成瘤及激光照射肿瘤变化）6. 移植宫颈癌肿瘤组织切片观察：组织学检查可见，金壳均匀分布于肿瘤组织内。对照组肿瘤细胞有明显异型性，细胞分化程度低，排列不规则，坏死面积较低。激光照射金壳组出现不同程度的肿瘤坏死，坏死面积明显高于对照组。(见图3) A:正常裸鼠肝癌模型（HE100） B:裸鼠肝癌模型激光照射后（HE200）图3：裸鼠成瘤激光照射前后的病理变化讨论宫颈癌是最常见的

16、妇科恶性肿瘤之一,在全球妇女恶性肿瘤中居第二位。据 WHO 报道全球每年约有20万妇女死于此病,其中5. 3万发生在我国4。近年来发病率呈上升和年轻化的趋势。宫颈癌主要的治疗手段是放疗，手术及综合治疗5。近几年热疗在宫颈癌的综合治疗受到越来越多的关注。根据热疗的温度不同，热疗又可分为常规高温热疗，固化热疗，气化热疗以及近年来提出的亚高温热疗（39.541.5）2 .而热疗的临床应用又以微波热疗与射频热疗居多。热疗温度越高对肿瘤的杀伤效果越好，但同时毒副作用就越大，因此提出了亚高温热疗的概念，其温度相对较低，对肿瘤的杀伤作用随之减弱。而临床常用的微波与射频热疗都是非选择性的，在热疗肿瘤组织的同时

17、不可避免的损伤到周围正常组织，对于年轻患者生活质量的影响就显现出来。而我们应用近红外激光诱导纳米金壳产热治疗宫颈癌的方法与上面提到的热疗方式有所不同。其最大的特点是热疗具有选择性。我们将纳米金壳通过尾静脉注入裸鼠体内，在EPR效应6的作用下金壳于肿瘤区域聚集，再通过人为选择激光照射区域进行激光诱导热疗，从而达到选择性热疗的目的。该治疗方法其选择性较好，效果确切，对周围正常组织损伤极小。纳米金壳产热的基本原理是：当粗糙金属表面受光照时，表面的电子被激发到高能级，与光波的电场耦合产生共振，使金属表面的电场增强，产生增强的拉曼散射，将金属表面吸收的光能转化为热能7。通过调节这种核壳结构金属纳米复合颗

18、粒材料的核壳比例来调节其在近红外波长处的吸收或散射性质。目前宫颈癌的治疗主要包括手术，放疗及综合治疗。对于中晚期宫颈癌尤其提倡综合治疗。而热疗在综合治疗中扮演非常重要的角色。它既可以通过温度升高杀伤肿瘤细胞，同时又是放射治疗的“增敏剂”，对化学治疗也起着重要的协同作用2。我们通过提高热疗温度保证杀伤肿瘤的效果，又对热疗进行了选择性诱导，仅对分布有纳米金壳的肿瘤区域进行加热，从而最大程度的保护了周围正常组织。最早由2003年美国Hirsch教授研制出直径110纳米的纳米金壳材料，通过理化分析发现其特有的产热功能，通过近红外激光诱导针对乳腺癌细胞进行了一些初步的体外实验研究，证实金壳诱导产热可抑制

19、肿瘤细胞增殖，且具有明显的选择性3。近年来，纳米金壳热疗治疗肿瘤的研究已成为热点。2008年美国Stern教授利用金壳材料对前列腺癌细胞进行了相关的体外试验研究，通过局部注射金壳8与静脉注射金壳9分别证实了其在近红外激光激发下可选择性杀伤前列腺癌细胞。Dickerson教授利用类似的纳米金棒材料进行了针对鳞状细胞癌的相关实验，得出了激光诱导纳米金棒可抑制鳞状细胞癌的结论10。目前关于纳米金壳热疗治疗肿瘤的研究国内尚未见报道。我们利用选择性近红外激光诱导金壳升温的特点，针对临床常见的宫颈癌细胞进行了一系列的体内体外试验，为今后近红外激光诱导金壳热疗应用于临床积累了一定的实验数据，初步验证了该治疗

20、方法的可行性和有效性。感谢：中科院理化研究所唐芳琼研究员提供纳米金壳。参考文献1 石峥，曲芃芃.热疗在宫颈癌中的研究进展J. 国外医学妇产科学分册, 2007,34(2): 131-134. 2 殷卓敏,俞华.宫颈癌热疗新进展J. 国际妇产科学杂志,2008,10(5): 332-335.3 L.R. Hirsch, R.J. Stafford, J.A. Bankson. Nanoshell-mediated near-infrared thermal therapy of tumors under magnetic resonance guidance, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003,100 : 1354913554.4Parkin DM ,Dray F , Ferlay J ,et al . Estimating the world cancer burden : Globocan 2000J . Int J cancer ,2001 ,94 :153.5 李爱玲, 吴爱如, 吴香达, 等.子宫颈肿瘤M.第 2 版.2010-2076.6 梅梅,袁守军.实体瘤的EPR效应及治疗策略J.解放军药学学报,2008,24(4):345-347.7 D. Patrick ON