微生物实验十

1、流感病毒的分离培养一、流感病毒的MDCK细胞分离方法二、流感病毒分离培养之鸡胚培养法 1一、流感病毒MDCK细胞分离方法（一）生物安全要求H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安全级别：BSL-3。实验操作人员需进行BSL-3防护，具体详见“生物安全个人防护SOP”。H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。2其余流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安全级别：BSL-2。实验操作人员需进行BSL-2防护，具体详见“生物安全个人防护SOP”。其余流感病毒的MDCK细胞分离操作

2、必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。3（二）材料1、7590成片的MDCK细胞，选用合适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做病毒分离2、胰酶（牛胰腺来源型）3、HEPES缓冲液，1M母液 4、D-MEM培养基，Hanks液5、青、链霉素母液（10000U/mL 青霉素G；10000g/mL硫酸链霉素 46、牛血清白蛋白组分，7.5%溶液7、临床样品0.5mL8、1mL无菌移液管9、10mL无菌移液管10、15mL无菌离心管5（三）实验步骤1、准备病毒生长液（1）细胞维持液准备500mL D-MEM液中加入青、链霉素母液 5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100g/mL链霉素）牛血清

3、白蛋白组分 12.5mL（终浓度：0.2%）HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度：25mM）6（2）病毒生长液每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的终浓度为2g/mL。2流感病毒MDCK细胞分离步骤：（1）7590成片细胞的准备，以选取T25细胞瓶为例。用40物镜观察细胞生长状态。轻轻倒出细胞生长液，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hanks液分别清洗细胞3遍。7（2）细胞培养瓶的接种用无菌的移液管将清洗细胞的Hanks液从细胞培养瓶中移出。用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中，温和摇动数次。然后放于37，5%CO2培养

4、箱中吸附12h。吸出接种物，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hanks液分别清洗细胞2遍。然后加入6mL病毒生长液于细胞培养瓶中。放置于3335培养箱培养。每日观察细胞病变情况。（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）。8（3）细胞培养物的收获当75%100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可以将细胞放于-70冰箱，冻融12次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次，然后用10mL的无菌移液管吸取病毒液置于15mL无菌离心管中，混匀病毒。收获的病毒液可以立即进行后续试验，或冻于-8

5、0冰箱待以后试验使用。9二、流感病毒分离之鸡胚培养法 （一）、检视标记鸡胚（1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚 胎的另一面形成明显的界限（2）标记出鸡胚的气室与尿囊的界限（3）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉10（二）、接种样本将标记好的鸡胚的气室朝上放置在照蛋器上。（2）用75酒精消毒鸡胚，用无菌镊子在气室端钻孔，再无菌眼科剪剪开10 x6mm窗口。 (3)用注射器吸800l标本。(4)从窗口中滴入无菌的液体石蜡，轻轻晃

6、动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射200l标本。将针头退出至寸，将另外200l标本注入鸡胚尿囊腔。每个样本接种2个鸡胚。11(5)将针头弃于合适的生物安全装置中(6)用消毒过的医用胶布封口(7)3335oC 温箱培养鸡胚23 天。临床采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养2天。注意：鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去12+”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不凝，在管底中心形成小红点。 “+”：约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，