神经系统的信号传递与电生理学研究方法课件

1、神经系统的信号传递与电生理学研究方法 一、神经系统的信号传递 二、电生理学方法介绍一、神经系统的信号传递1.电信号： 局部电位（localized graded potential）：感受器、突触后膜、运动终板。 动作电位（action potential）：在神经纤维上传到的AP称为神经冲动。2. 化学性信息（化学性突触传递） ：神经递质，激素。1. 神经元轴突内神经活动的电变化 在神经机制探索中，唯一最重要的发现是神经冲动与电位变化相一致。神经活动的电信号给予研究者一个研究神经系统功能的手段；电信号像一个失踪物，通过它，研究者可在活体的复杂结构中跟踪神经冲动的去向，同时，也是了解信息如何在

2、神经系统内编码的唯一线索。Measuring the resting membrane potential1) 电信号Methods of Reconding Action Potentials1)电信号Flipping the membrane potential by changing the relative ionic permeability of the membrane.神经纤维静息电位与动作电位波形与产生机制The voltage-gated channelStructure of the voltage-gated sodium channela. The molecule

3、consists of four domains, I-IV.b. An expanded view of one domain showing the voltage sensor of alpha helix S4 and the pore loop (red).c. The molecule arrange of domains form a pore between them.2. 神经元-神经元间化学性突触传递Synaptic arrangements in the CNSVarious sizes of CNS synapses 突触神经生理学是神经科学重要分支。研究突触电生理学、

4、结构、功能和神经化学。 人类神经系统每个细胞处在不同的反复分支的神经网络中。突触种类和大小复杂的。2. 神经元-神经元间化学性突触传递2. 神经元-神经元间化学性突触传递A membrane ion channelThe properties: ion selectivity and gating.A membrane ion channelThe properties: ion selectivity and gating.Transmitter actions at G-protein-coupled receptors. The binding of neurotransmitter t

5、o the receptor leads to the activation of G-proteins. Activated G-proteins activate effector proteins, which may be (a) ion channels or (b) enzymes that generate intracellular second messengers. 神经纤维上传导的动作电位（all or non ，不衰减性传导）：分析其频率、潜伏期、传导速度； 神经元胞体及树突产生的局部电位（幅度总和）：感受器，突触后膜EPSP、IPSP，运动终板； 神经递质和受体。 电

6、压和化学门控通道：理、化性质。总结：电生理学研究的指标二、电生理学方法细胞外纪录 (extracellular recording): 细胞内纪录 (intracellular single unit recording)：电压钳（voltage clamp）膜片钳（patch clamp） 脑电图 (EEG)诱发电位（evoked potential） 微电泳（microelectrophoresis） 抗体微量注射 正电子发射断层扫描术磁共振成像术（1) 阴极射线示波器（oscillograph）：显示电信号，电子流惰性小，是记录神经非常短促和微弱电流最好的方法。（2）生物电放大器(amp

7、lifier): 频率相应范围大（通频带从0100kHz），有足够高的放大能力，低噪声，高输入阻抗，高的辨差比。（3）电子刺激器（electronic stimulator）: 矩形脉冲：刺激强度（幅度: 最大瞬时值，0.001200V之间，连续可调）、时间（波宽：10s1s）、频率(波宽和延迟时间之和小于频率的倒数)、延迟 ；刺激方式：单，连续，双脉冲刺激；同步输出：触发其他需要与刺激同步的仪器（示波器，微电泳，照相等）一起工作。刺激隔离器（insulator）。（4） 储存和分析电生理实验结果的仪器：示波器照相机、录音机、计算机（叠加，直方图，平均等)。常用的主要仪器 电记录的技术(A)

8、细胞外记录法记录法记录单个细胞或一群细胞的电活动。(B) 微电极细胞内记录法记录膜内外的电位差：静息电位和动作电位。(C) 全细胞膜片钳记录法记录当膜上单个通道开启或关闭时的电流。工作原理：把引导电极安放在神经组织的表面或附近引导神经组织的电活动。活动部位的神经元去极化，未活动部位极化状态，在容积导体中两部位电位不同，电流流动，放置在细胞表面的电极会纪录出两者间的电位差。优点：方便，电极不插入细胞。特点：细胞外电位的波形因记录细胞的不同部位而异神经纤维外纪录： 细胞外纪录 Extracellular Recording CNS神经元细胞外记录：在接受其他神经元传来的兴奋性或抑制性的信息被激活后

9、，可再所记录神经元的被激活部位（电穴）和该神经元的其他部位（电源）间形成局部电流。玻璃微电极: 尖端直：0.5m; 电极电组：520M; 充灌液：3mol/L KCI, 4mol/L NaCI, 2%旁胺天蓝，0.5mol/L醋酸钠溶液pH7.7;）。钨丝金属微电极：尖端4070m, 电阻低，机械强度高，直接穿透硬脑膜，电噪声低，可反复使用；细胞外纪录 Extracellular Recording 根据细胞外记录微电极处于电源或电穴的位置关系，能记录一个极性不同的电位（正或负）。胞外电极记录的电位大小和波形会有多种变化。因此，重点分析放电频率和潜伏期，而不去比较放电的幅度。工作原理：在膜两侧

10、各置一个电极形成一个回路，记录膜电位（membrane potential）： EPSP, IPSP，动作电位。优点: 准确测量膜电位的绝对值， 因膜内到膜外电阻很大, 值可高达100mV。意义：是研究神经元基本生物物理特性的有效手段。关键问题（成功而持久的胞内记录）：1）稳定：排除机械和动物呼吸和循环功能引起的运动；2）合格的玻璃微电极。细胞内纪录 Intracellular Single Unit Recording(Hodgkin and Huxley)细胞内纪录 Intracellular Single Unit Recording 由于插入神经元内胞体并记录细胞内电位的微电极技术的发

11、展，Eccles等首先将微电极插入脊髓运动神经元的胞体，记录哺乳类动物脊髓的大运动神经元胞内电位。运动神经元的胞体直径70m;微电极尖端直径0.5 m；跨膜电位差6080mV。图7.3：用微电极在猫脊髓运动神经元内记录的突触后电位A.B.C:三种不同的阈下刺激(40秒扫描的叠加)； D:10次刺激引起的峰电位。图7.12：刺激神经在单根肌纤维的终板上所诱发的电位a. 正常终板电位和相继发生的肌肉峰电位；b,c,d,e: 箭毒进行性地阻滞肌反应; e只留下终板电位，神经肌肉传递被箭毒阻滞了。图7.2：枪乌贼星状神经节的突触前纤维表现的动作电位和在突触后神经元诱发的局部电位。 20世纪50年代，H

12、odgkin and Huxley 首次应用电压钳技术对枪乌贼的标本进行膜电流的测定。工作原理：离子流过通道所形成的离子流是形成动作电位的基础。电生理实验以电流作为刺激源，使可兴奋细胞产生兴奋，然后测定其膜电压以确定离子通道的状态。但在形成动作电位时所产生的离子流可影响膜电位，而膜电位的变化又会影响该离子的通透性的变化。因而，须人为地使膜电位在一定时间内维持在一个固定水平。电压钳技术是通过插入细胞内的一根微电极人为向胞内补充电流，补充的电流正好等于跨膜流出的反相离子电流（大小相等方向相反）。意义 ：1）确保膜通透性发生改变时，控制膜电位始终维持在指令电位的水平（不变）；2）通过电流检测装置，记

13、录到补充入胞内的注入电流，它相当于离子电流的反相电流。这样可测定在不同膜电位水平的离子电流，从而了解膜通道的电导及功能活动。电压钳 voltage clamp应用：定量分析刺激与细胞后膜电导的变化。反映整个细胞膜上所有通道活动的综合结果。不足：此项技术不能了解单个离子通道的功能活动状态。另外，牵制的面积大，包含大量的随机开放和关闭的通道，形成的背景噪音也大，掩盖单一通道的微弱电流，另外，小神经元插入两个电极不容易。电压钳装置图和电压钳实验记录的膜电流 1976年由德国Neher 和Sakmann 发明（1991 Nobel Prize）。工作原理：同电压钳，即在人为设置电压并固定的情况下记录分

14、析离子通道。膜片钳技术使用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个mm2的细胞膜通过负压吸引封接起来。由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端下的那片膜与膜的其他部分从电学上隔离。因此，片膜内通道开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的膜片钳放大器测量此电流强度，即代表单一离子通道电流。性能：电极尖端(15m)与膜之间电阻10 9 （ G, 10G100G）的高封接（giga-seals）, 大大提高了膜片钳的可靠性和灵敏性，可测量0.06pA的电流，1m的空间分辨力和10s时间的分辨力。意义：膜上电压依赖型离子通道有开与关两种电导状态。通道膜片钳技术可直接观察离子通道“开启”

15、和“关闭”。膜片钳 Patch ClampPatch clamping record ionic currents through single channels The patch contains a voltage-gated Na+ channel, Changing the membrane potential from 65 mV to 40 mV,Cause the channel to open,and current (I) will flow through it (e).The amplitude of the measured current at a constant

16、 membrane voltage reflects the channel conductance, and the duration of the current reflects the time the channel is open. a. A glass electrode onto the membrane of the neuronB. Applying suction through the electrode tip.c. Withdraw the electrode from the cell, the membrane patch was torn away.D. Io

17、nic currents was measured as steady voltages across the membrane.The opening and closing of Na+ channels upon membrane depolarization(a): The electrical potential across a patch of membrane. When the membrane potential is changed from 65-40mV, the Na+ channels pop open.(b): Three different channels

18、respond to the voltage step.(C) A model for how changes in the conformation of the Na+ channel protein might yield its functional properies.The shortcut pathway.（a）G-proteins in heart muscle are activated by ACh binding to muscanrinic receptors.(b) The activated G subunit directly gates a K+ channel

19、.A patch-clamp recording from a transmitter-gated ion channel. Ionic current passes through the channels when the channels are open in the presence of neurotransmitter. 1924年德国Jena, Hans Berger第一次纪录人类脑电图（脑电流描记术的大部分基础知识和脑电图的用途：生理、神经、精神和心理 ）。 双极或单极引导法: 将引导电极放在颅骨表面之上，记录脑活动时微弱电流，通过强力放大记录出来的电位成为脑电图（EEG）。

20、单极引导可更好地确定电信号的发源地，有利于临床病灶诊断定位。反映皮层锥体细胞的总和电位活动。锥体细胞的尖端树突相互平行，产生细胞外电流的总和。正常脑电图： ，两种节律。脑电图 Electroencephalogram图：正常成年人的典型脑电图注意节律在头的后部占优势The generation of large EEG signals by synchronous activity. (a) In a population of pyramidal cells under an EEG electrod, each neuron receives many synaptic inputs. (

21、b) If the inputs fire at irregular intervals, the pyramidal cell responses are not synchronized, and the summed activity detected by the electrode has small amplitude. (c) If the same number of inputs fire within a narrow window so that the pyramidal cell responses are synchronized, the resulting EE

22、G sum is much larger.影响脑电图的因素：1. 神经细胞代谢（缺氧、低血糖和酒精）：脑电图出现慢节律，电压降低。2. 药物：抗痉挛药，麻醉药：乙醚，巴比妥盐。EEG与知觉水平相关；3. 睡眠：EEG变化非常复杂。 发现：诱发电位电生理学始于1913 prevdish-Neminsky 的实验。（电刺激坐骨神经，皮层脑电图上出现明显的电波偏移。一种分布非常广泛的活动，是追踪外周冲动到达皮层通路的一种工具。 定义：中枢神经系统任何部位对于感受器官、感受神经、感觉通路上的任何一点受刺激时所产生的电变化。 性质：慢电位变化，主要是突触后电位总和而成。波幅一般在0.120V之间。由于波

23、幅小，多在自发放电的背景上产生诱发电位。 平均诱发电位（AEP）：诱发电位出现与施加的刺激有一定时间关系。相同实验条件下，同一系统，潜伏期的长短是恒定的。用计算机平均叠加技术把多次反应的微弱电信号叠加起来，使其从背景电波中清晰地记录。 临床应用：听觉诱发电位，视觉诱发电位，躯体感觉诱发电位.诱发电位 Evoked Potential躯体感觉诱发电位:在躯体感觉系统中，从楔核、丘脑和皮层可记录到刺激外周神经引起的反应。刺激右侧上肢皮肤在左侧中央后回纪录的诱发电位a. 感受器电位；b.双极细胞；C. 色素细胞图10.7 “注意”时皮层反应的变化 不论受试者是否“注意”短声或警惕短声即将来临，耳蜗神

24、经反应无显著变化，而皮层反应出现明显的CNV.微音器电位：多个毛细胞感受器电位的总和。A与B对比说明，声音位相改变时，微音器电位位相倒转，而听神经复合动作电位位相不变。 应用光学记录技术，把特别研制的荧光染料与细胞膜结合，在有动作电位发生时，这种燃料的光吸收特性发生改变。 正电子发射断层扫描术（positron emission tomography, PET） 磁共振成像术（magnetic resonace imaging） 显示清醒人的大脑中受刺激区域，或发动运动时的活动状态。神经元活动的无创伤技术正电子发射断层扫描术Positron Emission Tomography, PETA.

25、看一个词B. 听一个词C. 说一个词D. 想一个词利用正电子湮灭反应的物理学特性，以及脑激活时脑的能量代谢加强，血流量增加及血液容积改变等生物学特性，总和而成的最先进的脑功能检侧技术。PET扫描首先将能发射正电子的放射性核素（18F 或15O）标记到选定的化合物上，然后将它引入体内。放射性核素在衰变过程中发射出正电子，与邻近组织中的电子相遇后湮灭，探测器确定其位置。 脑功能性磁共振成像术 Magnetic Resonace Imaging功能性磁共振成像技术检测视皮层的功能活动A 未刺激时组织的去氧血红蛋白比例高；B. 刺激后组织氧合血红蛋白增高；C. 视觉刺激后脑影像视皮层活动区。突触前神经

26、末梢的递质以量子式释放的，量很微少。因此在进行神经递质功能测定时，只能用最小而有效的剂量模拟神经递质的生理功能。这是与药理学方法明显的区别。药理学研究可能用很大的剂量，所引起的效应可能与生理效应不同甚至相反。 微电泳（microelectrophoresis） 抗体微量注射 神经递质的功能测定 定义：借助微电极通以一定的电流将解离物质电泳到神经元附近，观察神经递质或其他药物对该神经元的作用。 基本原理：外加电流通过含解离物质溶液的微电极时，会将微电极内的解离物质从管尖释放出来。例如在微电极接正极，动物头皮接负极时，带阳离子的物质从微电极中释出。相反，微电极接负极，头皮接正极（内向电流）时，微电极释出的是带负离子的物质。微电泳时解离物质从微电极释出量，与它通过的电荷量成正比。因此，通常用微电极的电流强度表示解离物质的释放量。（3）方法：1）拉制微电极：五管：每管尖端直径1-3m, 五管总直径510m.其中，一管为纪录，一管为对照，三管为药物。2）微电极充满溶液后，在立体定位以帮助下，姜微电极插至所需要观察的脑核团内的神经元附近。微电泳仪上的输出接头通过Ag-AgCI细丝插入微电极各管中，另一共用接头连在动物头