手足口病的实验诊断ppt课件

1、手足口病的实验诊断安徽省疾病预防控制中心 2021 . 3 . 11手足口病的病原手足口病hand-foot-mouth disease, HFMD由人肠道病毒感染引起。人肠道病毒为小RNA病毒科Picornaviridae，肠道病毒属Enterovirus的一组单股正链RNA病毒。其中包括埃可病毒31个血清型、柯萨奇病毒A组23个血清型和B组5个血清型，还包括3个脊髓灰质炎病毒血清型和人肠道病毒68-71型。 Courtesy of Linda M. Stannard, University of Cape Town, S.A.h30nm二十面体对称无包膜人肠道病毒的毒粒构造人肠道病毒发现的

2、历史脊髓灰质炎病毒：1909年初次鉴定出该病毒，1949年，利用细胞培育的方法增殖病毒，为疫苗的研制奠定了根底。柯萨奇病毒：1948年在美国纽约Coxsackie镇，将两名麻木患儿的标本接种至乳鼠体内，分别出来的一组病毒定名为柯萨奇病毒。根据它们在乳鼠上产生的组织病理学变化和在细胞培育上的才干，分为柯萨奇病毒A组和B组。埃可病毒：1951年在一名无病症的儿童的粪便标本中分别到，在细胞培育上可以呵斥致细胞病变，但对乳鼠和灵长类动物不致病。新肠道病毒：随后新发现的病毒被按照序号命名6971，最近，曾经命名至102型肠道病毒主要血清型手足口病的常见致病病原多种肠道病毒都可引起HFMD，主要为：柯萨奇

3、病毒A组的47、9、10、16型B组的13、5型埃可病毒的部分血清型肠道病毒71型 最常见的为CV-A16和EV71 肠道病毒的抵抗力肠道病毒无包膜，乙醚、75%酒精、外表活性剂等均不能将其灭活。对紫外线及枯燥敏感；各种氧化剂高锰酸钾、漂白粉等、甲醛或56 30min都能灭活病毒病毒在4可存活1年，-20可长期坚持感染性 病毒RNA有感染性。一粪便标本采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量58g/份，采集后立刻放入无菌采便管内，4暂存立刻(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保管的标本存于70冰箱。二脑脊液标本出现神经系统病症的病例，要采集脑脊液标本，进展病原

4、和抗体检测。采集时间为出现神经系统病症后3日内，采集量为1.02.0ml。采集后立刻装入无菌带垫圈的冻存管中，4暂存立刻(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保管的标本存于70冰箱。手足口病的标本采集手足口病的标本采集三血清标本 采集急性期(发病05天)和恢复期(发病1430天)双份配对血清用于抗体检测。检测IgM时，采集 (发病720天)血。静脉采集35ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分别血清，将血清置于20以下冰箱中冷冻保管。 四咽拭子标本 采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用公用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应防止触及舌部；迅速将棉签放入

5、装有35ml保管液细胞维持液的采样管中，在接近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，4暂存立刻(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保管的标本存于70冰箱。五疱疹液可同时采集多个疱疹作为一份标本，用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有35ml保管液维持液或生理盐水的采样管中，在接近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4暂存立刻(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保管的标本存于70冰箱。手足口病的标本采集标本采集器械要求注射器：医用5ml和10ml一次性注射器棉拭子：塑料杆全血搜集管：10ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)血清保管管：2 ml

6、螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温液氮保管粪便保管管：5-20 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温液氮保管-全国POLIO网络实验室鼻咽拭子保管管：10 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温液氮保管痰液保管管：50 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温液氮保管尸检组织冻存管：50ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)；尸检每一个样品换手术刀记号笔：油性，防水标本采集器械要求病人标本的采集运输和保藏 在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液 中分别病毒具有很高的诊断价值。 用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保管液中，如维持液或生理盐水，以防枯燥。

7、标本采集本卷须知标本采集本卷须知为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。 不能立刻检测的标本应冷冻保管。 对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病2-4周后采集。手足口病的诊断普通是经过采集适当的临床标本后进展基因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分别和病鉴定手足口病的实验室诊断手足口病的实验室诊断方法病毒分别抗体检测核酸检测蛋白/核酸芯片标本病毒分别CPE阳性RT-PCR及序列测定肠道病毒非肠道病毒测双份血清中和抗体滴度RT-PCRReal time RT-PCR检测病毒核酸序列测定无CPE常规实验补充实验中和定型手足口病的实验室检测

8、流程病毒分别培育用于病毒分别的标本： 包括粪便、咽拭子和疱疹液，假设患者出现神经系统病症，可以采集脑脊液标本适用的细胞 RD细胞人胚胎横纹肌肉瘤细胞、Hep-2细胞人喉上皮癌细胞病毒分别培育标本的处置 1、粪便：2g 加PBS 10ml，振荡混匀，1500g低温离心20min，上清0.2ml接种敏感细胞 2、咽拭子：于采样管中充分洗涤拭子， 4下 10000rpm离心20min，上清0.2ml接种敏感细胞 3、脑脊液和疱疹液：直接接种病毒分别培育培育察看： 36培育逐日察看，第1代培育见可疑CPE 至察看满7天后再继续冻融传代，待稳定CPE出现后, - 20或- 70冻存以备进一步鉴定； 假设

9、7天之后没有出现CPE，需盲传2代继续察看，盲传2代后仍不出现CPE那么断定为阴性；鉴定：中和实验血清抗体检测方法 中和实验、 ELISAIgM：单份血：急性期IgG ：双份血：急性期，恢复期阴转阳，四倍升高，四倍降低均可诊断近期感染病毒核酸检测RT-PCR RT-PCR(Reverse Transcriptase PCR)用于RNA病毒的检测，酶促催化使RNA逆转录成cDNA第一链，逆转录与第一次PCR在同一系统内进展，逆转录完成后，加热灭活逆转录酶，然后开场PCR扩增。一条寡聚脱氧核苷酸引物先与mRNA杂交，然后由依赖RNA的DNA聚合酶催化合成相应互补的cDNA拷贝，后者能进一步用于PC

10、R扩增。病毒核酸检测RT-PCR方法特点：快捷、简便高度灵敏、特异具有病原诊断意义高效的通用型技术平台 粪便标本：采用氯仿进展处置。 肛拭子/咽拭子标本：咽拭子要在标本保管液中充分搅动，然后在4下，10000 rpm离心20min 。 疱疹液和脑脊液：直接用于RNA提取。标本的预处置可运用商业化试剂盒从临床标本中提取病毒RNA 简化操作、规范方法、条件一致、排除干扰QIAGEN Viral RNA Mini Extraction KitCAT：52904适宜临床标本和病毒培育物标本QIAGEN Rneasy Mini KitCAT： 74104 适宜组织和咽拭子标本RNA的提取引 物人肠道病毒

11、包括EV71、CA16、CA24v、EV70核酸检测通用引物 PE2上游：5- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3 PE1下游：5- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3 EV71核酸检测引物序列：EV71-S上游：5- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3EV71-A下游：5- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3引 物CA16核酸检测引物序列：Cox A16-S上游：5-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3Cox A16-A下游；5-TCA GTG T

12、TG GCA GCT GTA GG-3 引 物根据本人实验室的实践情况建立各自RT-PCR反响体系配以下试剂主溶液：10PCR Buffer含Mg2+5.0ldNTPs2.5mM each 2.0l上游引物0.1g/l1.0l下游引物0.1g/l1.0lRNA酶抑制剂RNasin,40U/l 0.5lTaq DNA聚合酶5U/l 0.5lAMV逆转录酶10U/l 1.0l模板RNA 3.0lRNase Free dH2O 36.0l 50.0l反响体系在PCR仪上进展RT-PCR反响，反响步骤如下：4245min953min9520s5025s 32个循环 7230s7210min 4Soak

13、 温度循环参数经过比较标本的PCR产物与阳性对照的PCR产物在凝胶上的位置以及大小来解释结果。 结果解释RT-PCR实验结果解释实验室诊断原那么人肠道病毒在自然界广泛存在且种类繁多，一病多原、一原多症是肠道病毒感染的重要特征。因此应对血清诊断及病原诊断的实验室结果作严厉评价，必需结合临床病症及环境要素流行病学分析，以确立病毒与疾病的病原学关系。普通采取的原那么为：1病毒分别阳性率远高于对照人群；2病程中有特异性抗体变化并排除其他病毒感染；3从病变组织中分别出病毒。从疑为肠道病毒感染的脑炎/脑膜炎患者的脑脊液中检测到相应的肠道病毒核酸RT-PCR法，或分别到病毒或肠道病毒IgM阳性，即可证明是该

14、肠道病毒引起的中枢神经系统感染。从疑为死于EV71或其它肠道病毒的尸检标本中检测到相应的肠道病毒核酸，或分别到病毒或肠道病毒IgM阳性，即可证明是该肠道病毒是病因。从HFMD患者的疱疹液中检测到相应的肠道病毒核酸，或分别到病毒，那么该病毒就是病因病原。实验结果的诊断意义实验结果的诊断意义 当无法进展病毒分别或未分别到病毒时，血清学诊断方法可以作为病毒感染的间接证据。肠道病毒有时引起无病症感染，只从个别HFMD患者粪便标本中分别到EV71或其它肠道病毒时，不能随便下结论EV71是病因，应该扩展样本量，所以实验结果的实践意义应结合临床过程和流行病学资料进展解释。手足口病检测实验室相关问题 1、实验室生物平安问题：必需注重的问题实验人员受过生物平安培训 有防备潜在生物危害的认识 熟习生物平安规程，掌握生物平安技艺实验室本人的生物平安指南合格的生物平