流感病毒核酸检测作业指导书

1、流感病毒核酸检测作业指导书1 适用范围适用于鼻拭子、咽拭子、漱口液、鼻腔冲洗液、鼻腔吸取物、气管吸取物等样品中流感病毒的核酸PCR检测。2 原理基于PCR原理进行的核酸检测。3 仪器设备3.1 QIACube工作站3.2 ABI7500荧光定量PCR仪器3.3 核酸电泳仪3.4 离心机3.5 -20冰箱、-70冰箱、28冰箱3.6移液器（1-10L，10-100L，100-1000L）4 试剂耗材4.1 QIAGEN核酸抽提试剂盒4.2 PCR试剂盒4.3 不同规格移液枪头4.4 1.5 mL Eppendorf 离心管5、操作步骤5.1 核酸提取5.1.1 使用QIAGEN手工抽提试剂盒进行

2、核酸抽提5.1.1.1 试剂准备Carrier RNA试剂的准备：将310L Buffer AVE加入到1管冻干的Carrier RNA（310g）中，混合均匀，彻底溶解Carrier RNA；将溶解的Carrier RNA分装34小管，于-20冰箱保存。临用时根据具体样品量进行Buffer AVL工作液的配置。每管Carrier RNA反复冻融不得超过3次。Buffer AVL工作液的配置：Buffer AVL原液保存于正常室温条件下，使用前观察有无结晶。若有，可置于80温度下少于5min快速溶解后使用。根据下列公式计算各成分含量进行Buffer AVL工作液的配置。 n 0.56mL =

3、y mL； y mL 10L/mL = z L n表示本次试验所要抽提的总样品数，包括空白阴阳性对照数；y 表示计算所得要使用的Buffer AVL工作原液；z 表示计算所得要使用的含Carrier RNA的Buffer AVE（Carrier RNA-AVE）的量；下表列举出1-12个样品Buffer AVL工作液配制所要使用的Buffer AVL原液与Carrier RNA-AVE的量。样品数量Buffer AVL原液（mL）Carrier RNA-AVE（L）样品数量Buffer AVL原液（mL）Carrier RNA-AVE（L）10.565.673.9239.221.1211.28

4、4.4844.831.6816.895.0450.442.2422.4105.6056.052.8028.0116.1661.663.3633.6126.7267.2含Carrier RNA的Buffer AVL工作液4保存48小时有效，使用前置37水浴让结晶溶解，并混匀。Buffer AW1工作液：（按下表配制，配制好的工作液室温保存）产品号规格（人份、盒）AW1加入量96100%酒精加入量最终体积511045019mL25mL44mLBuffer AW2工作液：（按下表配制，配制好的工作液室温保存）产品号规格（人份、盒）AW1加入量96100%酒精加入量最终体积511045013mL30m

5、L43mL说明：上述各表是根据目前所使用试剂配制所需的各成分含量，当试剂改进后需根据新的试剂说明书进行试剂的配制。5.1.1.2核酸抽提5.1.1.2.1取1.5mL离心管，加入560L Buffer AVL工作液；5.1.1.2.2分别加入140L标本、阴性对照、临界阳性对照、强阳性对照，涡旋振荡混匀15秒；5.1.1.2.3 室温放置10分钟，瞬间离心；5.1.1.2.4 加入560L浓度为100%乙醇，涡旋振荡混匀15秒，瞬间离心；5.1.1.2.5 取630L上述液体加入带有2 mL废液离心管的QIAamp离心柱，8000rmp离心1分钟；弃去滤液，换一个干净的废液收集管；5.1.1.

6、2.6 重复2.5；5.1.1.2.7 打开QIAamp离心柱，加入500L Buffer AW1工作液；2.8 8000rmp离心1分钟，弃去滤液；5.1.1.2.9打开QIAamp离心柱，加入500L Buffer AW2工作液，14000rmp离心3分钟，弃去滤液；5.1.1.2.10 将QIAamp离心柱放入一个2mL废液收集管，14000rmp离心1分钟；5.1.1.2.11 将QIAamp离心柱放入一个1.5mL离心管，打开QIAamp离心柱，加入平衡至室温的AVE洗脱液60L，室温放置1分钟，8000rmp离心1分钟。离心后的液体即为抽提的RNA；5.1.1.2.12 在离心管上

7、标记编号，包括样品编号、样品性质、抽提日期；5.1.1.2.13 标记好后置-70冰箱保存待用。5.1.2 使用QIACube工作站进行核酸抽提5.1.2.1试剂准备Carrier RNA试剂的准备：将310L Buffer AVE加入到1管冻干的Carrier RNA（310g）中，混合均匀，彻底溶解Carrier RNA；将溶解的Carrier RNA分装34小管，于-20冰箱保存。临用时根据具体样品量进行Buffer AVE工作液的配置。每管Carrier RNA反复冻融不得超过3次。Buffer AW1工作液：（按下表配制，配制好的工作液室温保存）产品号规格（人份、盒）AW1加入量96

8、100%酒精加入量最终体积511045019mL25mL44mLBuffer AW2工作液：（按下表配制，配制好的工作液室温保存）产品号规格（人份、盒）AW1加入量96100%酒精加入量最终体积511045013mL30mL43mL需要注意的是，使用QIACube工作站进行核酸抽提，Buffer AVL工作液使用原液，这是与QIAGEN手工抽提试剂盒进行核酸抽提时试剂配制的不同之处。下表列出了2-12个样品（不能进行1或11个样品抽提）进行核酸抽提时部分试剂的配制量。样品数量Buffer AVE（L）Diluted carrier RNA（L）2256125（28 carrier RNA +

9、97 Buffer AVE）3364150（33.6 carrier RNA + 116.4 Buffer AVE）4472175（39.2 carrier RNA + 135.8 Buffer AVE）5580200（44.8 carrier RNA + 155.2 Buffer AVE）6688225（50.4 carrier RNA + 174.6 Buffer AVE）7796250（56 carrier RNA + 194 Buffer AVE）8904275（61.6 carrier RNA + 213.4 Buffer AVE）91012300（67.2 carrier RNA

10、+ 232.8 Buffer AVE）101120325（72.8 carrier RNA + 252.2 Buffer AVE）121336375（84 carrier RNA + 291 Buffer AVE）说明：上述各表是根据目前所使用试剂配制所需的各成分含量，当试剂改进后需根据新的试剂说明书进行试剂的配制。5.1.2.2 试剂、耗材等的放置5.1.2.2.1 各试剂的安放根据仪器说明书的要求准备好试剂；5.1.2.2.2 硅胶膜过滤柱及1.5mL Eppendorf管的安放 根据仪器说明书的要求准备好过滤柱与样品收集管；5.1.2.2.3 样品的安放根据仪器说明书的要求准备好样品；5

11、.1.2.2.4 离心吊篮的安放根据仪器说明书的要求在指定位置安放好离心吊篮。5.1.2.3 程序运行根据仪器设备的液晶显示面板，选择RNA核酸抽提，抽提过程中不得随意打开仪器盖子，否则程序运行会终止。如意外情况导致仪器设备程序运行被迫终止，可从终止时的步骤开始，继续根据手工试剂盒的抽提方法进行核酸抽提。5.2 基因扩增5.2.1 Real-time PCR5.2.1.1 使用试剂盒QIAGEN Quantitect RT-PCR CAT No.2044435.2.1.2 反应体系Rnase free water2Master MixRT-MixForwardReverseProbeRNA模板总计5.5L12.5L0.25L0.5L0.5L0.75L5L25L5.2.1.3 循环参数60 5min50 30min95 15min95 15s 55 30s 7230s72 5min1114515.2.2 RT-PCR5.2.2.1 反应体系Rnase free water5RT-PCRBuffer10mM dNTP MixtureEnzyme MixRnase Inhibitor上游引物下游引物总计10.9L5L1L1L0.1L1L1L20L5.2.2.2 循环