标准免疫组织化学技术及应用(两节课)新版

1、免疫组织化学技术(jsh)及应用 南方(nnfng)医科大学病理教研室张进华 共二百零四页 概念(ginin) 免疫组织化学（免疫组化）技术是利用已知的特异性抗体或抗原能特异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗原上的显示剂，如酶，金属离子、荧光素、同位素等，显示一定的颜色，并借助显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的一门新兴组化技术。 共二百零四页 免疫组化是组织化学吸收了免疫学的理论和技术发展(fzhn)起来的一门重要的方法学，在现代生物学领域中广泛应用，尤其在医学的基础和临床研究中发挥着重要的作用，对疾病尤其是肿瘤的诊断、鉴别

2、诊断及发病机理的研究提供了强有力的手段。共二百零四页 免疫组化是一种综合技术，除抗原抗体的制备、抗体的标记外，还包括细胞组织材料的准备（包括标本取材与贮存(zhcn)及固定、组织脱水、浸蜡、包埋等），缓冲液及有关试剂的配制。共二百零四页在染色过程中： 实验方案的设计、 抗体的稀释、 内原性过氧化物酶的阻断， 非特异性染色的消除、 染色对照的准确设计 结果的分析判断。只有掌握了这些(zhxi)技术，才能做好高质量的免疫组化切片。 共二百零四页 抗原(kngyun)和抗体：共二百零四页抗原（antigen） 凡能刺激(cj)机体产生相应抗体或致敏淋巴细胞，并能与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的物

3、质称为抗原。物质所具有的这种特性称为抗原性（antigenicity），即抗原性具有免疫原性和反应原性两种基本属性。 共二百零四页抗体(antibody) 是机体(jt)受抗原刺激后，在体液中出现的一种能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。它是构成动物及人类体液免疫作用的主要物质。 共二百零四页多克隆抗体(kngt) 制备共二百零四页共二百零四页单克隆抗体(kngt)制备 共二百零四页共二百零四页免疫荧光细胞化学技术原理： 免疫荧光细胞化学是根据(gnj)抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（抗体）。共二百零四页 在细

4、胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮(mngling)的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位、以及利用定量技术测定含量。 共二百零四页 用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法，用已知的荧光抗原标记示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常用(chn yn)。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。 共二百零四页共二百零四页共二百零四页共二百零四页常用的荧光(ynggung)素 1、异

5、硫氰酸荧光素(FITC) 荧光色 苹果绿 2、四乙基罗达明（RB200）荧光色红色 3、cy3荧光色 红色 4、AMCA荧光色 蓝色荧光 5、ELF荧光色 黄绿色 共二百零四页 免疫荧光细胞化学分直接法、夹心(jixn)法、间接法和补体法。共二百零四页一、直接法 1、检查抗原法这是最早的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。此法十分特异和简便(jinbin)，但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。 共二百零四页共二百零四页 2、检查抗体法：将抗原标记上荧光素，即为荧光抗原，用此荧光抗原与细胞

6、(xbo)或组织内相应抗体反应，而将抗体定位检测出来。 共二百零四页二、间接法 1、检查(jinch)抗体法（夹心法）此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。 共二百零四页共二百零四页2、检查抗体法 用已知抗原细胞或组织标本的切片，加上待检查血清，如果其中含有切片中某种抗原的抗体，抗体使沉淀结合在抗原上，再用间接(jin ji)荧光抗体（抗种属特异性IgG荧光抗体）与结合在抗原上的抗体反应（如检测人血清中的抗体必须用抗人IgG荧光抗体等），在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异

7、性荧光。此法是检验血清中自身抗体和多种病原抗体的重要手段。 共二百零四页3、检查抗原法（间接法） 此法是直接法的重要改进，先用特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（或称第一抗体）与细胞标本反应(fnyng)，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（也称第二抗体，种特异性）与结合在抗原上的抗体（是第二抗体的抗原）结合，形成抗原抗体荧光抗体的复合物。 共二百零四页共二百零四页 由于(yuy)结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合35个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合35分子的荧光抗体，所以直接法相比荧光高密度可增强3或4倍。共二百

8、零四页 此法除灵敏性高外，它只需要制备一种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示(xinsh)。这是现在最广泛应用的技术。共二百零四页三、补体法 1、直接检查组织内免疫(miny)复合物法用抗补体C3等荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，而形成抗原抗体补体复合物抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物存在处，此法常用于肾穿刺组织活检诊断等。 共二百零四页共二百零四页 2、间接检查组织的内抗原法常将新鲜补体与第一抗体(kngt)混合同时加在抗原标本切片上，经37孵育后，如发生抗原抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗

9、体与结合的补体反应，形成抗原抗体抗补体荧光抗体的复合物，此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种属来源的第一抗体的标记显示。 共二百零四页 四、双重免疫荧光标记法 在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时，要进行双重荧光染色，一般(ybn)均采用直接法，将两种荧光抗体（如抗A抗B）以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TMRITC或RB200标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。 共二百零四页共二百零四页免疫(miny)酶细胞化技术共二百零四页原理 酶标记抗体原理和荧光抗体法相似，先用结合剂（戊二醛）

10、将酶结合在抗体免疫球蛋白分子的氨基或羟基上而形成酶标记抗体。直接法是将酶直接标记在抗体上，然后和相应抗原反应，使抗原抗体复合物上带有酶分子，再与酶的底物H2O-DAB（3,3一二胺基联苯胺）呈色反应，在抗原抗体反应部位形成棕色或深棕色产物，借以研究抗原物质(wzh)颁布和性质。 共二百零四页目前常用的方法有 1、 直接(zhji)法 2、 间接法 3、 三步法共二百零四页免疫组化室常用小设备冰箱(4 、-18 )；贮存免疫组化试剂用。18cm不锈钢高压锅，电炉(1000-1500W)或微波炉(700-800瓦)(抗原修复用，可任选一种)，电炉或微波炉，1000ml烧杯；3 . 孵育盒、塑料(s

11、lio)耐高温切片架；冲洗瓶、定时器、塑料试管、5-10ml玻璃试管等；100l 、200 l 、20 l 可调微量移液器各1支；相应的吸嘴。磨砂玻片；PAP划圈笔；空调1台；恒温箱1台；10. pH计1台(PHS-25型)。共二百零四页共二百零四页共二百零四页共二百零四页共二百零四页抗原修复(xif) 目前进行的常规石蜡切片标本，一般均用甲醛固定。 共二百零四页 事实上经甲醛固定(gdng)的部分组织细胞，免疫组化标记敏感性明显降低，其原因为： （1）在用甲醛固定过程中形成醛键而封闭了部分抗原决定簇 共二百零四页 （2）甲醛在保存进程中会形成(xngchng)羧甲基，而封闭抗原决定簇 共二百

12、零四页 （3）在用固定剂固定时，会使蛋白蛋白之间发生交联，也可能会封闭抗原决定簇，因此在染色时，有些抗原需先进行(jnxng)修复或暴露。国内外一些试剂公司已将需要做抗原修复的抗体注明在产品目录或商品化抗体的说明书中。 共二百零四页抗原修复(xif)方法一般分为: 化学方法 物理/化学方法 共二百零四页 (一)化学(huxu)方法（酶消化方法） 1、胰蛋白酶（trypsin）消化方法 酶浓度一般为0.050.1%，配制方法：取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml0.05%或0.1%PH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可用。消化条件和时间：将切片旋转在湿盒，371040min，一般为2

13、0min即可。 共二百零四页 2、胃蛋白酶(pepsin)消化方法(fngf)0.4%胃蛋白酶，用0.1mol/l,PH7.4的PBS中，消化时间为37,20min。主要用于细胞间质抗原的显示如纤粘素、胶原酶等。 共二百零四页 3、链霉蛋白酶（ponase）消化(xiohu)方法 浓度为0.1%、该酶溶于0.5mol/l，PH7.4的Tris-Hcl中，消化时间为20min。 共二百零四页 4、无花果蛋白酶（ficin）消化(xiohu)方法其浓度基本与胰蛋白酶相似，溶在PBS（PH7.4）中即可用于消化，消化时间为20min。 共二百零四页 5、菠萝(blu)蛋白酶消化方法 其浓度为0.4%

14、1%，溶在0.01mol/l，PH7.4的PBS中，消化时间为20min。 共二百零四页 6、尿素消化方法 有人认为尿素消化可以提高组织中抗原抗体(kngt)反应，尤其是用于单克隆抗体(kngt)的石蜡切片，有时较蛋白酶消化效果好。方法为3mol/l尿素水溶液处理切片5min。 共二百零四页胰蛋白酶溶液 胃蛋白酶溶液和无花果蛋白酶溶液现有即用型产品销售，具有效果(xiogu)好、使用方便、保存期长等优点。 共二百零四页 在选择酶消化时，应针对要显示的抗原成分不同而不同，同时可根据抗体说明书的要求加以选择，一般来说，胃蛋白酶和菠萝(blu)蛋白酶主要用于细胞间质抗原的消化，其余均为细胞内抗原的消

15、化。弱消化用无花果蛋白酶，中度消化用胰蛋白酶，强消化用胃蛋白酶，但在日常工作中用胰蛋白酶消化即可。 共二百零四页物理/化学方法 1、单纯加热方法将片子入盛有柠檬酸盐缓冲液的容器中，置电炉上加热至沸腾(fitng)，并持续10min。 共二百零四页 2、高压加热方法 将片子(pin zi)放入盛有柠檬酸盐缓冲液的高压锅内，置电炉上对喷气，并持续2min。 共二百零四页 3、微波方法 将片子(pin zi)放入盛有柠檬酸盐缓冲液的容器中，置微波炉上加热合温度保持在92100，并持续25min，在第1次5min后可视柠檬酸盐缓冲液是否有蒸气减少，如有，可适当加蒸馏水后再进行第2次的min。值得一提的

16、是各个病理科所使用的微波炉型号不同，应适当加以摸索调试，以掌握最佳的实验条件。 共二百零四页柠檬酸盐缓冲液的配制(pizh)：A液称取21.01g柠檬酸溶于1000ml蒸馏水中。B液 称取29.41g柠檬酸钠溶于1000ml蒸馏水中。工作液取9mlA液和41mlB液加入450ml蒸馏水中，调PH6.00.1/6.00.1。共二百零四页 有关抗原修复中的作用机理尚不完全清楚，可能与下列因素有关： 1、化学反应 细胞中抗原决定簇因甲醛(ji qun)等化学物质使其封闭，化学物质分子或离子与部分决定簇相结合产生化学反应，增加细胞和组织的通透性，以便抗体与抗原最大限度结合。 共二百零四页 近年来，许多

17、学者通过利用重金属（znso4）、柠檬酸盐缓冲液、尿素、PBS液等多种修复液，结果抗原修复有不同程度的差别，说明化学效应(xioyng)的存在。 共二百零四页2、热效应 组织切片在高温下使某些已被封闭的抗原(kngyun)决定簇得以重新暴露和修复。 共二百零四页3、微波直接作用(zuyng) 组织切片在调频电磁波作用下，可打开蛋白质间交联链，使抗原决定簇中化学键获得修复。 共二百零四页消除内源性过氧化物酶 这是在免疫酶技术中对一切组织标本切片必须早些处理的一个步骤。由于切片内可能原有过氧物酶存在，当用免疫酶法显色时，这种内源性酶的活性同时显示出来，造成对抗体上酶标记(bioj)混淆。 共二百零

18、四页 为清除这种染色的干扰，一般采用(ciyng)含3%H2O2的甲醇预先处理切片10min。可用2.28%过碘酸氧化5分钟，以抑制内源酶的活性。 共二百零四页 非免疫血清阴滞组织内反应部位 1、无关动物正常血清（1：20） 孵育(f y)20分钟。 2、第二抗体同种动物的正常血清 共二百零四页 改善组织的透过性 在染色前对组织切片须要处理的另一步骤就是改善组织的透过性。当待检抗原被考虑是存在(cnzi)细胞内，而抗体是大分子的时候，抗体就很难通过细胞的质膜顺利达到接触抗原。 共二百零四页 因此，对涂片、组织培养标本、细胞悬浮液的材料等细胞内抗原(kngyun)，必须使细胞膜易于为大分子抗体所

19、透过，以利于染色。共二百零四页 采取的办法： 用净化剂即表面活性剂三硝基甲苯(ji bn)（Triton）X100溶解于PBS中的0.21%液体，例如浸洗组织切片或涂片。共二百零四页 标记酶的要求 凡对抗体无毒性又具有高催化(cu hu)效率的酶，理论上均可标记抗体。 共二百零四页 1、性质较稳定；比活性高。 2、该酶应当是适度纯的制品。 3、酶结合物要稳定，便于观察和保存实验结果。当该酶与其它分子（如抗体）交联后，必须继续(jx)保留着它的活性部位和催化能力。 共二百零四页 4、被检组织内最好(zu ho)没有底物有关的酶作为内源性组分存在。 共二百零四页 5、酶的相应底物易于(yy)制备和

20、保存，价格低廉，酶分子量不能太大。 共二百零四页 目前已纯化的数百种酶中，要完全能符合上述要求(yoqi)是很困难的，只能基本符合。 共二百零四页 常用(chn yn)于标记的酶 1、 辣根过氧化物酶 2、碱性磷酸酶 3、酸性磷酸酶 4、葡萄糖氧化酶。 共二百零四页 5、D半乳糖苷酶 6、葡萄糖淀粉酶。 7、乙酰胆碱脂酶 8、苹果酸脱氢酶 9、溶菌酶 10、6磷酸(ln sun)葡萄糖脱氢酶 共二百零四页 在免疫酶技术中，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶的应用(yngyng)比较广泛。最近国外报道应用(yngyng)葡萄糖氧化酶进行免疫组织化学的双重染色。 共二百零四页辣根过氧化物酶标记的产物显色

21、原理(yunl)：HRP+H2O2 HRP+H2O2供氢体（电子供体） HRP+H2O2供氢体（氧化型）共二百零四页共二百零四页DAB(Diaminobenzidine)显色液DAB即3,3-二氨基(nj)苯联胺试剂：DAB 50mg PBS(0.01mol PH7.2)100ml 30%双氧水 30-40微升 共二百零四页免疫酶组织化学染色1直 接 法用酶标记的特异性抗体直接与标本中的相应抗原结合，再与酶的底物作用产生有色的产物，沉积在抗原-抗体反应部位，即可对抗原进行定性、定位及定量(dngling)研究。 共二百零四页直接法简便、快速、特异性强，非特异性背景反应低。常用于检查肾组织(zz

22、h)活检标本中的IgG、IgA、IgM、C3和C4等免疫复合物成分，以及系统性红斑狼疮和其他结缔组织疾病、皮肤疾病的检查，但必要时需做间接法对照。 共二百零四页操作步骤: (1)石蜡切片脱蜡至水。 (2)根据每一种抗体的要求，对组织抗原进 行相应的修复(xif)。 (3)每张切片加1滴或50l过氧化物酶阻断 溶液(3%H2O2)，以阻断内源性过氧化物 酶的活性，室温下孵育10分钟。 共二百零四页 (4)PBS冲洗33min。 (5)甩去PBS液，每张切片(qi pin)加1滴或50l 的非免疫性动物血清，室温下孵育10 分钟。 (6)甩去血清，每张切片滴加50l酶标 抗体于切片上，3730mi

23、n或室温1h。 (7) PBS冲洗33min。 共二百零四页 (8)甩去PBS液，每张切片加2滴或100l新鲜配 制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3-10分钟， 阳性显色为棕色或红色。 (9)自来水冲洗，苏木素复染。 (10)如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干 燥，(二甲苯透明)，中性(zhngxng)树胶封固；如果用 AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用 水性封片剂封片。 共二百零四页2间接法先用未标记的特异性抗体(一抗)与标本中相应抗原反应，再用抗特异性抗体的酶标记抗体与结合在抗原上的一抗反应。该法的优点(yudin)是用一种酶标记抗体就可与多种一抗配合探测多种抗原，因此

24、广泛应用于自身抗体、癌胚抗原、病毒、细菌、寄生虫检查。 共二百零四页操作步骤: (1)石蜡切片脱蜡至水。 (2)根据每一种抗体的要求，对组织抗原进 行相应的修复。 (3)每张切片加1滴或50l过氧化物酶阻断 溶液(3%H2O2)，以阻断内源性过氧化物 酶的活性，室温(sh wn)下孵育10分钟。 共二百零四页 (4)PBS冲洗33min。 (5)甩去PBS液，每张切片加1滴或50l的非免 疫性动物血清，室温下孵育10分钟。 (6)甩去血清，每张切片加1滴或50l的第一 抗体，室温下孵育60分钟或4过夜，建议(jiny) 参阅每种抗体的说明书。 (7)PBS冲洗33min。 共二百零四页 (8)

25、 每张切片滴加1滴或50lHRP标记的二 抗，37 30min或室温60min。 (9) PBS冲洗33min。（10）甩去PBS液，每张切片加2滴或100l 新鲜配制的DAB或AEC溶液(rngy)，显微镜下观 察310分钟，阳性显色为棕色或红色。 共二百零四页 （11）自来水冲洗，苏木素复染。 （12）如果用DAB显色，则切片(qi pin)经过梯度 酒精脱水干燥，（二甲苯透明）， 中性树胶封固；如果用AEC显色， 则切片不能经酒精脱水，而直接用 水性封片剂封片。 共二百零四页亲和免疫细胞化学技术 亲和细胞化学（affinity cytochemistry）是利用两种物质之间的高度亲和能力

26、而互相结合的化学反应。免疫细胞化学与亲和细胞化学相互结合，提高了亲和细胞化学的定位专一性和免疫细胞化学的灵敏度，减少(jinsho)了非特异性反应，两者合称为亲和免疫细胞化学（affinity immunocytochemistry）。共二百零四页早期发现的有高度亲和能力的物质是卵白素-生物素，生物素（biotin）即维生素H，卵白素（avidin）现统称抗生物素，具有4个与维生素H亲和力极的结合点，它们之间的亲和力比抗原(kngyun)抗体的亲和力高100万倍，既能牢固结合又不影响彼此生物活性及与其结合物的活性，这一系统现被称为抗生物素-生物素系统。 共二百零四页根据上述原理建立(jinl)

27、的技术方法有抗生物素-生物素-过氧化物酶复合法（avidin-biotin-peroxidase comples technique，ABC法）、桥抗生物素-生物素法（bridged avidin-Biotin technique，BRAB法）、标记生物素-抗生物素（labelled avidin-Biotin technique，LAB法）、葡萄球菌蛋白A-辣根过氧化物酶法（stephylococcal protein A，SPA法）、链霉亲合素蛋白-过氧化物酶连接法（streptavidin-peroxidase complex，SP法）链霉亲合素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法（Stre

28、pt Avidin-Biotin Complex SABC法）等。 共二百零四页目前被发现的亲和素物质还有凝集素（lectin）与糖结合物，激素与受体，脂质与受体，多聚合物与HRP抗体，以及维生素与其作用(zuyng)部位等。 共二百零四页1ABC染色方法 抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术（avidin biotin-peroxidase complex technique，简称ABC技术）。ABC法是许世明于1981年在BRAB法和LAB法的基础上改良的，其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记(bioj)的第二抗体和生物素标记(bioj)的酶。 共二百零四页与LAB法和BRAB法不同的是

29、第一抗体不为标记物所标记，生物素标记的第二抗体与ABC复合物相连接。复合物是将过氧化酶结合在生物素上、再将生物素-过氧化酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备的，最后进行显色(xin s)反应定位。 共二百零四页（一）亲和素-生物素-过氧化物(u yn hu w)酶（Avidin Biotin-peroxidase Complex，ABC）技术 1基本原理共二百零四页操作步骤：（1）石蜡切片脱蜡至水。（2）根据每一种抗体的要求，对组织(zzh) 抗原进行相应的修复。（3）每张切片加1滴或50l过氧化物 酶阻断溶液（3%H2O2），以阻断内 源性过氧化物酶的活性，室温下 孵育10分钟。 共二百零

30、四页 （4）PBS冲洗33min。 （5）甩去PBS液，每张切片加1滴或50l 的非免疫性动物(dngw)血清，室温下孵育10 分钟。 （6）甩去血清，每张切片加1滴或50l的 第一抗体，室温下孵育60分钟或4 过夜，建议参阅每种抗体的说明书。 （7）PBS冲洗35min。 共二百零四页 （8） 甩去PBS液，每张切片加1滴或50l 生物素标记的第二抗体，室温(sh wn)下孵育 30分钟。 （9） PBS冲洗33min。 （10）甩去PBS液，每张切片加1滴或50l ABC复合物，室温下孵育30分钟。 （11）PBS冲洗33min。 共二百零四页（12）甩去PBS液，每张切片加2滴或100l

31、新鲜 配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3 10分钟，阳性显色为棕色或红色。（13）自来水冲洗，苏木素复染。（14）如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱 水干燥，（二甲苯透明）中性树胶(shjio)封固； 如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水， 而直接用水性封片剂封片。 共二百零四页ABC法有以下(yxi)优点 共二百零四页 敏感性高：抗生物素同生物素结合有四个位点，一部分同生物素化过氧化物酶结合，另一方面同生物标记的抗体结合。在ABC反应中，抗生物素作为桥边接于生物素标记的酶和生物素标记的抗体之间，而生物素标记的过氧化物酶分子又可作为桥连接于抗生物素分子之间，于是形成了一个(y )含

32、有3个以上过氧化物酶分子的网格状复合物，敏感性极大提高。 共二百零四页特异性强，背景淡：由于敏感性高，第一抗体和第二抗体都可被高度稀释，减少了非特异性染色。方法简便，节约时间：由于ABC法敏感，操作(cozu)的抗原抗体反应的时间可缩短为2h左右。由于生物素与抗生物素具有多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。 共二百零四页4SP染色(rns)方法 共二百零四页链霉菌抗生物素蛋白（SA）是从链霉菌中分离出的蛋白质，分子量为60KD，穿透(chun tu)组织的能力比ABC，复合物大，反应速度快。它含有四个亚基，每个亚基都具有与生物素（Biotin）联接的部位，且二者间有极强的亲和力，S

33、A的等电点接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）为10。 共二百零四页因此，SA几乎不与组织中的内源性凝集样物质发生非特异性结合，使用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶放大系统，即可产生低背景、高放大效果，经过多年来的实验应用，证明(zhngmng)SP放大系统比传统的ABC法更为简单，敏感、特异。 共二百零四页目前，免疫组化染色超敏试剂盒，它是根据链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶（Streptavidin-Peroxidase，SP ）连接系统设计的，S-P免疫组化染色试剂盒采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物(u yn hu w)酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗

34、原。 共二百零四页（三） S-P （ streptavidin peroxidase）技术(jsh)1、基本原理共二百零四页操作步骤：（1）石蜡切片脱蜡至水。（2）根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行 相应的修复。（3）每张切片加1滴或50l过氧化物酶阻断(z dun)溶 液（3%H2O2），以阻断内源性过氧化物酶 的活性，室温下孵育10分钟。 共二百零四页（4）PBS冲洗33min。（5）甩去PBS液，每张切片加1滴或50l 的非免疫性动物血清(xuqng)，室温下孵育 10分钟。（6）甩去血清，每张切片加1滴或50l 的第一抗体，室温下孵育60分钟或 4过夜，建议参阅每种抗体的说明 书。共

35、二百零四页（7） PBS冲洗35min。（8） 甩去PBS液，每张切片加1滴或50l生物 素标记的第二抗体(kngt)，室温下孵育20分钟。（9） PBS冲洗35min。（10）甩去PBS液，每张切片加1 滴或50l链霉 菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵 育20分钟。 共二百零四页(11)PBS冲洗35min。(12)甩去PBS液，每张切片加2滴或100l 新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下 观察3-10分钟，阳性显色为棕色或红色(hngs)。(13)自来水冲洗，苏木素复染。 共二百零四页(14)如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精(jijng)脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；

36、如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。 共二百零四页5Envision染色(rns)方法 共二百零四页Envision(Enharnced labeled-polymer system)技术是DAKO公司最近(zujn)推出的新方法。它将辣根过氧化物酶标记的多聚合物再标记在抗兔或抗鼠的IgG上，并螯合形成一个巨大复合物。每1mol/L复合物中，约含70mol/L的HRP和10mol/L抗兔和抗鼠IgG。因此，每1个复合物中的HRP绝对数量显著高于ABC和SP复合物，其敏感性高于目前其他几种酶标记方法。 共二百零四页Envision法基本原理是，在切片上加上一抗以后第二

37、抗体标记多聚螯合物酶(AP或HRP)的复合物与一抗体结合(jih)，在多聚螯合物上有大量的HRP分子，比其他传统方法使抗原有了显著的放大，比ABC、LSAB、SP高出几十倍，因多聚物是人体内不存在，无非特异性染色，背景非常干净。 共二百零四页鉴于Envision复合物内含多个第二抗体分子，故有效增强了该复合物与特异性抗体的结合(jih)机会和能力。由于此技术将酶聚合物直接标记第二抗体，因此，整个染色方法只需两步即可完成，而其他方法则需三步，从而使染色时间大幅度缩短。 共二百零四页共二百零四页操作步骤：(1)石蜡切片脱蜡至水。(2)根据每一种抗体的要求，对组织抗原(kngyun) 进行相应的修复

38、。(3)每张切片加1滴或50l过氧化物酶阻 断溶液(3%H2O2)，以阻断内源性过氧化 物酶的活性，室温下孵育10分钟。 共二百零四页(4)PBS冲洗33min。(5)甩去PBS液，每张切片加1 滴或50l 的非免疫性动物血清(xuqng)，室温下孵育10 分钟。(6)甩去血清，每张切片加1 滴或50l的 第一抗体，室温下孵育60分钟或4过 夜，建议参阅每种抗体的说明书。(7)PBS冲洗35min。 共二百零四页(8) 甩去PBS液，每张切片加1滴或50l 的第二抗体标记多聚螯合物-酶复合 物，室温下孵育(f y)30分钟。(9) PBS冲洗35min。(10)甩去PBS液，每张切片加2滴或1

39、00l 新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下 观察3-10分钟，阳性显色为棕色或红色。 共二百零四页(11)自来水冲洗，苏木素复染。 (12) 如果用DAB显色，则切片经过梯度 酒精脱水干燥，(二甲苯透明(tumng)，中 性树胶封固；如果用AEC显色，则 切片不能经酒精脱水，而直接用水 性封片剂封片。 共二百零四页6Ramos染色(rns)方法 共二百零四页Ramos法(rapid microwave one step method)是一种快速免疫组化一步法，它利用微波热效应(xioyng)和化学效应(xioyng)，与DAKO公司Epos酶标记特异性抗体相结合，以加速其抗原抗体结合反应为

40、其特点，这是目前国内外最快速而较完美的新方法。该法的特点是快速、简便、特异。灵敏。质量稳定及结果可靠。 共二百零四页【特点】 (1) 快速：本法整个标记程序在10min内即可完成。 (2)敏感性高：本法不同于以往(ywng)酶标直接法。它先将HRP标记在一个惰性的聚合物上，形成一个酶标记复合物(每一个mole复合物中含70mole HRP)，再用酶标复合物标记各种特异性抗体，最后形成HRP-聚合物-特异性抗体复合物。由于酶标记抗体中HRP绝对数量多，故其敏感性较ABC和LSAB高数倍。 共二百零四页(3)特异性强，无背景着色：由于该法为一步法，无内源性生物素的干扰，加之应用了微波辐射技术(js

41、h)，故抗原抗体反应时间很短，所以该法基本无背景着色。(4)成本低：由于本法采用盖玻片法，每张切片只需25l酶标抗体，因此降低了成本，而且无边缘效应，染色更均匀。(5)无脱片现象发生。(6)该法适用于石蜡。冷冻和细胞涂片。 共二百零四页操作步骤:(1)组织经中性甲醛常规固定、脱水。石 蜡包埋切片。(2)组织切片常规脱蜡至水。(3)微波抗原(kngyun)修复，切片柠檬酸缓冲液内 (250ml)，置微波炉中功率(350W)辐射 约120s，温度控制在80内，冷却至 室温。 共二百零四页(4)PBS洗涤，吸干切片周围(zhuwi)多余的水分。(5)每张切片加25l聚合物-酶标记抗体， 加盖玻片(2

42、2mm22mm)，置微波炉中 功率辐射60s左右，静置35min。(6)PBS洗2次，每次2min。 共二百零四页(7)DAB-H2O2显色510min，或置微波低中功 率(280W)辐射40s左右。(8)自来水冲洗，苏木素复染。(9)如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱 水干燥，(二甲苯透明(tumng)，中性树胶封固； 如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水， 而直接用水性封片剂封片。 共二百零四页7CSA染色(rns)方法 共二百零四页CSA(catalyzed signal amlplification)法1989年首次由Bobrow等报道应用于免疫酶联吸附试验和蛋白电泳转移膜的检测

43、，1992年由Adams等将该方法应用在免疫组织化学的检测中，1995年Kerstens等又将该方法应用到原位杂交技术领域(ln y)，该法比ABC、SP法具有更高的敏感性和稳定性等优点，CSA在原位杂交检测HPV、p16、HBV、Bcl-2、nm23、P-qg等DNA和RNA的检测都已获得满意的结果。 共二百零四页CSA原理是，特异性一抗和组织细胞内抗原结合后，滴加生物素化二抗，在链霉亲和素上的HRP催化下，立刻在抗原抗体结合部位形成一个共价结合位点，这一反应使大量的生物素沉积在信号位点上，然后加上生物素化的酪胺，当再一次滴加streptavidin-HRP复合物时，因在信号上存在许多的生物

44、素，而使酶分子复合物越积越多，通过底物使原始信号得到几何级的放大(如原始信号还得不到应有的放大，可使上述(shngsh)循环再来一次)。敏感性较常规SP法要高近1000倍。 共二百零四页操作步骤：(1)石蜡切片脱蜡至水。(2)根据(gnj)每一种抗体的要求，对组织抗原 进行相应的修复。(3)每张切片加1滴或50l过氧化物酶阻 断溶液(3%H2O2)，以阻断内源性过氧化 物酶的活性，室温下孵育10分钟。(4)PBS冲洗33min。 共二百零四页(5)甩去PBS液，每张切片加1滴或50l的 非免疫性动物血清，室温下孵育10分钟。(6)甩去血清，每张切片加1滴或50l的第 一抗体，室温下孵育60分钟

45、或4过夜， 建议参阅每种抗体的说明书。(7) PBS冲洗35min。(8)甩去PBS液，每张切片加1滴或50l生 物素标记(bioj)的第二抗体，室温下孵育30 分钟。共二百零四页(9) PBS冲洗33min。(10)甩去PBS液，每张切片加1滴或50l链 霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温 下孵育(f y)30分钟。(11)PBS冲洗33minj。(12)生物素化酪胺基团分子3720min； PBS洗35min。 共二百零四页(13)甩去PBS液，每张切片(qi pin)加1滴或50l链霉抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育30分钟。(14)甩去PBS液，每张切片加2滴或100l新鲜配制的D

46、AB或AEC溶液，显微镜下观察3-10分钟，阳性显色为棕色或红色。 共二百零四页(15)自来水冲洗，苏木素复染，0.1%HCl分化，0.1%氨水或PBS冲洗返蓝。(16)如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水(tu shu)干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。 共二百零四页 结果(ji gu)判断标准 1、每批染色都要有特异慢性对照和阴性对照为基础，都能对染色结果做判断。 共二百零四页 2、阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。 3、阴性结果不能视为抗原不表达，即阴性结果无判断(pndun)意义；阳性结果有强弱、多

47、少之分，哪怕是一个细胞阳性，只要是在抗原所在部位，也有诊断意义。 共二百零四页 4、当免疫组化结果与HE切片诊断有矛盾(modn)时，以HE切片诊断为准。 5、应用“反证法”确保免疫组化在诊断病理中的准确性。 共二百零四页 6、避免假阴性和假阳性的发生。造成判断失误的主要原因，假阳性；标本固定不佳，标本选择不恰当，标本干燥，抗原扩散(kusn)；抗体的交叉反应，抗体的吸附，内源性，外源性，假阴性；标本脱蜡不充分，抗原性的变化和破坏，抗原性的变化和破坏，抗原的隐匿性，抗体的失活。 共二百零四页免疫组化应用的范围(fnwi) 在常规病理诊断中应用免疫组化主要有以下8个方面。 共二百零四页 1、对肿

48、瘤(zhngli)的组织起源进行鉴别诊断，如上皮性、间叶性、肌源性、血管源性、淋巴细胞源性等。 共二百零四页 2、对肿瘤的良恶性进行综合判断，如Ki-67、PCNA等抗体对肿瘤增生(zngshng)程度的判断，CEA、AFP等对癌分化程度的判断等。共二百零四页 3、发现微小转移灶，如对淋巴结内极少转移性肿瘤细胞的查找，对骨髓内个别(gbi)转移性瘤细胞的认定等。 共二百零四页 4、激素受体的检测以指导临床治疗(zhlio)，目前主要是乳腺癌雌、孕激素的检测。 5、激素类细胞的定性和定位，以进一步明显内分泌细胞的类型和功能状态。 共二百零四页 6、指导肿瘤分期， 可通过免疫组化对基底膜、血管浸润

49、得到清楚的显示而获得准确(zhnqu)的分期。 7、指导肿瘤预后的判断，如目前开展的瘤基因的免疫组化检测，瘤细胞抗药性的检测等。 共二百零四页 8、免疫性疾病的辅助诊断，如肾小球肾炎、某些皮肤疾病等组织内免疫球蛋白、补体、复合物的检测。其中应用(yngyng)最多的还是肿瘤鉴别诊断。 共二百零四页共二百零四页共二百零四页共二百零四页共二百零四页共二百零四页共二百零四页共二百零四页共二百零四页共二百零四页共二百零四页共二百零四页共二百零四页共二百零四页MAB-0023CD30福尔马林固定(gdng)，石蜡包埋。何杰金氏淋巴瘤，CD30/KI-1阳性定位胞膜，UltraSensitiveTM SP

50、（Mouse）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SP X 400共二百零四页MAB-0023CD30福尔马林固定，石蜡包埋。何杰金氏淋巴瘤，CD30/KI-1阳性定位(dngwi)胞膜多核瘤巨细胞阳性，UltraSensitiveTMSP（Mouse）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SP X 400共二百零四页MAB-0198Cerbb-2福尔马林固定，石蜡包埋。乳腺导管癌，Cerbb-2(M)阳性(yngxng)定位胞浆和胞膜，UltraSensitiveTM SP（PAN）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SP X 100共二百零四页RAB-0046Cerbb-2福尔马林(f r m ln)固

51、定，石蜡包埋。乳腺癌，Cerbb-2阳性定位胞浆和胞膜，UltraSensitiveTM SP（PAN）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SP X 400共二百零四页RAB-0046Cerbb-2福尔马林固定，石蜡包埋。乳腺浸润性导管癌，Cerbb-2阳性定位胞浆和胞膜， UltraSensitiveTM SP（PAN）试剂盒，DAB显色(xin s)，苏木素复染。SP X 200共二百零四页RAB-0046Cerbb-2福尔马林固定，石蜡包埋。乳腺浸润性导管癌，Cerbb-2阳性(yngxng)定位胞浆和胞膜， UltraSensitiveTM SP（Mouse）试剂盒，DAB显色，苏木素复染

52、。SP X 400共二百零四页MAB-0049CK(Pan)福尔马林固定，石蜡(sh l)包埋。食道鳞癌，CK（PAN）阳性定位胞浆， UltraSensitiveTM SP（PAN）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SP X 200共二百零四页RAB-0050CK(PAN)福尔马林(f r m ln)固定，石蜡包埋。食道鳞癌，CK（PAN）阳性定位胞浆， UltraSensitiveTM SP（PAN）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SP X 100共二百零四页MAB-0041CD68福尔马林固定，石蜡包埋。恶性纤维组织细胞瘤，CD68阳性定位巨噬细胞胞浆，UltraSensitiveTMSP

53、（PAN）试剂盒，DAB显色(xin s)，苏木素复染。SPX 200共二百零四页RAB-0048CgA福尔马林固定，石蜡包埋。肺神经内分泌(fnm)癌，嗜铬素A阳性定位胞浆，UltraSensitiveTM SP（PAN）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SP X 200共二百零四页MAB-0182CK18福尔马林固定(gdng)，石蜡包埋。结肠腺癌，CK18阳性定位胞浆， UltraSensitiveTM SP（Mouse）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SP X 200共二百零四页MAB-0062ER福尔马林固定(gdng)，石蜡包埋。乳癌，ER阳性定位胞核， UltraSensitive

54、TMSP（PAN）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SP X 400共二百零四页RAB-0070Factor 福尔马林固定，石蜡包埋。乳腺导管癌，Factor 阳性(yngxng)定位胞浆， UltraSensitiveTM SP（PAN）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SPX 100共二百零四页MAB-0088GST-福尔马林固定，石蜡包埋。食道(shdo)鳞癌，GST-阳性定位胞浆， UltraSensitiveTM SP（Mouse）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SP X 200共二百零四页MAB-0100Insulin福尔马林(f r m ln)固定，石蜡包埋。正常胰腺，Insulin

55、阳性定位胰岛-细胞胞浆，UltraSensitiveTM SP（PAN）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SP X 100共二百零四页MAB-0100Insulin福尔马林固定(gdng)，石蜡包埋。正常胰腺，Insulin阳性定位胰岛-细胞胞浆，UltraSensitiveTM SP（PAN）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SP X 200共二百零四页MAB-0129Ki-67福尔马林固定(gdng)，石蜡包埋。乳腺癌，Ki-67阳性定位胞核， UltraSensitiveTM SP（Mouse）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SP X 400共二百零四页MAB-0129Ki-67福尔马林固定

56、，石蜡(sh l)包埋。乳腺癌，Ki-67阳性定位胞核， UltraSensitiveTM SP（PAN）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SP X 200共二百零四页MAB-0098Melanoma福尔马林固定，石蜡(sh l)包埋。淋巴结转移性恶性黑色素瘤，Melanoma阳性定位胞浆， UltraSensitiveTM SP（Mouse）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SP X 200共二百零四页MAB-0269Hsp60福尔马林固定，石蜡包埋。结肠腺癌，Hsp60阳性定位胞浆， UltraSensitiveTM SP（PAN）试剂盒，DAB显色(xin s)，苏木素复染。SPX 200共

57、二百零四页MAB-0245MMP-9福尔马林固定，石蜡包埋。乳腺癌，阳性(yngxng)定位胞浆，UltraSensitiveTMSP（PAN）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SPX 200共二百零四页MAB-0124Myosin福尔马林固定，石蜡包埋。横纹肌肉瘤，Myosin阳性(yngxng)定位胞浆， UltraSensitiveTM SP（PAN）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SPX 100共二百零四页MAB-0145PCNA福尔马林固定，石蜡包埋。胃腺癌，PCNA阳性(yngxng)定位胞核， UltraSensitiveTM SP（PAN）试剂盒，DAB显色，苏木素复染。SPX 100共二百零四页MAB-0224P-glycoprotein福尔马林固定(gdng)，石蜡包埋。胃腺癌，Pgp 阳性定位胞浆， UltraSensitiveTM SP（Mouse）试剂盒，DAB显色，苏木素