K562细胞外泌体诱导特异性CTL生成的研究

1、K562细胞外泌体诱导特异性CTL天生的研究陈绍倩，杜英，王鑫，顾巧丽，黄玉敏，董子明【摘要】为了研究人白血病细胞株K562细胞排泄的外泌体(exses)及K562细胞总RNA刺激人树突状细胞D排泄的外泌体可否诱导出K562细胞特异性TL，接纳四步离心法提取K562细胞及K562细胞总RNA刺激人树突状细胞的造就上清液中的外泌体，并诱导TL天生，以四甲基偶氮唑蓝(TT)法检测TL对K562细胞的杀伤作用。结果表现：K562细胞外泌体和K562细胞RNA刺激的D和外泌体均能显着促进对K562细胞的杀伤活性，与未经外泌体作用的比拟组比拟有明显性差异P0.05。外泌体作用后对K562细胞的杀伤作用显

2、着比对HL-60细胞的杀伤作用强，其差异有明显性P0.05。结论：K562细胞外泌体可以或许诱导出特异性抗白血病细胞的免疫反响。【关键词】K562细胞；树突状细胞；外泌体；细胞毒T淋巴细胞PrdutinfSpeifiTLInduedbyExsesDerivedfrK562ellsKeyrdsK562ell；dendritiell；exse；yttxiTlyphyte外泌体exse是一种直径在50-90n的亚细胞双层膜颗粒,抗原呈递细胞衍生的外泌体携带有富厚的抗原呈递所必要的H-、H-、共刺激分子和热休克卵白平分子；肿瘤细胞衍生的外泌体还携带有肿瘤相干抗原，能诱导肿瘤相干抗原的特异性TL反响，是

3、一种有用的抗原转运呈递载体1,2。Zitvgel等3的动物体内实行结果表现，用实体肿瘤抗原打击树突状细胞D，其外泌体可以诱发荷瘤小鼠的肿瘤排挤效应。rse等4的一期临床实行用非小细胞肺癌AGE-A3或A4抗原打击盼望期非小细胞肺癌患者(AGE抗原阳性)自体树突状细胞，得到D衍生的外泌体，这种携带AGE肿瘤抗原的D衍生的外泌体可以诱导AGE特异性T细胞反响并使一部门病人的病情得到缓解和操纵，提示D衍生的外泌体可以作为无细胞治疗性肿瘤疫苗用于肿瘤的免疫治疗。外泌体在实体肿瘤方面的研究陈诉较多，而在白血病方面的陈诉却甚少，因此我们提取了白血病细胞株K562细胞及K562细胞总RNA刺激人树突状细胞的

4、外泌体，不雅察了其诱导的抗白血病细胞的作用，创造其外泌体能诱导K562细胞特异性TL，现陈诉如下。质料和要领重要试剂尺度胎牛血清、淋巴细胞分散液(TBD公司产物);rhG-SF、rhIL-4、rhIL-2(Peprteh公司产物)；完全造就基RPI1640Gib公司产物;小鼠抗人H-I、H-II、D54IA-I、D86B7-2、D80B7-1、D40单克隆抗体Anell公司产物；胶体金标识表记标帜马抗小鼠IgG(华美公司产物)。二甲亚砜、四甲基偶氮唑蓝(Siga公司产物)；TRIzL试剂(Invitrgen公司产物)；DTAP脂质体Rhe公司。细胞株造就K562细胞株和HL-60细胞株系郑州大

5、学底子医学院保存株。K562和HL-60细胞于含10%的胎牛血清(56灭活30分钟)、1105U/L青霉素、100g/L链霉素、510-5l/L2-巯基乙醇和110-3l/L谷氨酰胺的RPI1640造就液，在37、5%2造就箱中造就。K562细胞总RNA制备根据TRIzL试剂说明书抽提处于对数生恒久的K562细胞总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完备性，紫外分光光度仪测定A260和A280数值。D的诱导和造就从正凡人外全面血细胞得到贴壁细胞，调解浓度至5105/l，悬浮造就于RPI1640完全造就液中，别离参加终浓度为100ng/lrhG-SF和500U/lrhIL-4,隔天半量换液，增补奇

6、怪造就液及细胞因子以诱导天生D。取上述制备的K562细胞总RNA(25l/250lpti-E)和DTAP(50l/250lpti-E)各250l，室温下在聚苯乙烯试管中混淆20分钟,混淆物参加造就5天的D，在37造就箱孵育4小时。4小时后吸出造就上清,参加含rhG-SF和rhIL-4的RPI1640完全造就液继承造就。外泌体的提取取对数生恒久的K562细胞和K562细胞总RNA刺激的D的造就上清，按文献外泌体4步离心法分散5,6，即：4300g离心10分钟;1200g离心30分钟；10000g离心30分钟；末了，100000g超速离心60分钟，所得到的沉淀即为外泌体。用PBS将外泌体，1000

7、00g超速离心60分钟，洗1遍后，用PBS100l重悬,用BA法举行定量，低温保存备用。K562细胞外泌体刺激D诱导TL的天生外周血非贴壁细胞过尼龙毛柱得到T细胞，参加IL-2(终浓度5105U/L)造就扩增。上述外周血D造就5天后分组，一组参加终浓度为20g/l的K562细胞外泌体与D共孵育24小时作为实行组D，另一组不加外泌体继承造就24小时作为比拟组D。将实行组和比拟组的D和T淋巴细胞按120混淆，继承造就3天诱导TL天生，然后参加靶细胞K562细胞和HL-60细胞，效靶比为201，TT法测2组T细胞对K562细胞和HL-60细胞的杀伤活性7。TL杀伤活性=靶细胞比拟组A值-实行组A值-

8、效应比拟组A值/靶细胞比拟组A值100%。RNA刺激的D及外泌体诱导TL的天生取第7天K562细胞总RNA刺激D(实行组D)和未刺激D(比拟组D)，同上述要领诱导TL天生，并测2组T细胞对K562细胞的杀伤活性。取RNA刺激的D和未刺激的D排泄的外泌体各10g/l，分为2组：未刺激D排泄外泌体组(比拟组)和RNA刺激D排泄外泌体组实行组，诱导TL天生，用上述要领测各组对K562细胞的杀伤活性。统计学阐发实行数据以XSD表现，应用SPSS11.0统计软件举行统计学处置惩罚，接纳2查验，以a=0.05为查验水准。结果外泌体、RNA和D的断定如今对外泌体的断定重要依靠形态学不雅察和卵白组身阐发。我们

9、对从造就上清液中所提取的分散样品举行了电子显微镜超微布局的不雅察、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)卵白带型的阐发及标识表记标帜性分子的estern胶体金免疫要领检测，结果表白我们的分散样品正是外泌体。同样也对所提取的K562细胞RNA做了琼脂糖凝胶电泳，用紫外分光光度仪测定其A260和A280数值，检测证实所提取的K562细胞RNA未落解。所诱导的D在形态和标识表记标帜性分子的表达测定也表白诱导出了典范的树突状细胞。K562细胞外泌体诱导的TL细胞杀伤活性我们用通例四步离心法提取K562细胞造就上清液中的外泌体，后者作用于D并诱导TL天生，以K562细胞作为靶细胞，不雅察对其杀伤作用。在效靶比

10、为201和401时，外泌体作用后诱导的TL对K562细胞的杀伤率(实行组)和外泌体未作用诱导的TL比拟组对K562细胞的杀伤率比拟力，实行组杀伤活性显着增高(P0.05)。外泌体作用后的TL对K562细胞的杀伤率(实行组)与对HL-60细胞的杀伤率比拟力，外泌体作用后的TL对K562细胞的杀伤率也显着增高(表1)，提示外泌体作用后的TL对K562细胞的杀伤有特异性。这说明K562细胞外泌体作用于D后诱导的TL对K562白血病细胞有特异性杀伤活性。Table1.KillingativityfTLinduedbyK562ellexsestK562ellsandHL-60ells略RNA刺激D及外泌

11、体诱导的TL天生用RNA提取试剂盒提取K562细胞RNA，然后用提取到的RNA刺激正凡人树突状细胞并提取后者造就上清液中的外泌体。分组检测RNA刺激D刺激D为实行组，未刺激D为比拟组和RNA刺激D外泌体诱导的对K562细胞的杀伤活性RNA刺激D外泌体为实行组，RNA未刺激D为比拟组。RNA刺激D实行组诱导的杀伤活性和比拟组比力，杀伤活性显着增高表2。同时用K562细胞RNA刺激正凡人树突状细胞造就上清液提取到的外泌体直接刺激T淋巴细胞，诱导TL天生实行组，后者对K562细胞的杀伤作用和未刺激比拟组比力，也较显着加强，提示抗原荷载后的树突状细胞外泌体有直接诱导抗原相干的TL杀伤白血病细胞的作用(

12、表3)。Table2.TLativityinduedbyDsativatedithK562ellRNA略Table3.TLativityinduedbyexsesfDsativatedithK562ellRNAGrupKillingativity略讨论肿瘤的免疫治疗不停都是肿瘤研究的一大热门，从早期的IL-2、IFN、LAK细胞到比年的树突状细胞疫苗，渐渐地从非特异性向特异性靠近，获得了令人煽动的结果8-10，但都存在如许或那样的不敷，外泌体那么为我们展示了一片新天地。近些年对外泌体的研究创造，差异细胞排泄的外泌体有着差异的生理作用。造血细胞，尤其是抗原呈递细胞衍生的外泌体携带有富厚的抗原呈递

13、所必要的H-、H-、共刺激分子和热休克卵白平分子，肿瘤细胞衍生的外泌体还携带有肿瘤相干抗原，是一种有用的抗原转运呈递载体，能直接或间接作用于树突状细胞、T细胞和NK细胞等，在体内发挥着免疫调治作用，并且体内作用结果更好，实体瘤方面的临床实行结果提示，外泌体有很大潜能作为一种新型疫苗用于肿瘤的治疗3,4。推测白血病细胞外泌体也有这种作用，因此我们研究了白血病细胞株K562细胞外泌体是否也能诱导出特异性杀伤K562细胞的免疫应答，白血病外泌体是否也有大概用于白血病的治疗，实行结果验证了我们的推测：白血病细胞外泌体可以诱导出特异性TL免疫反响；同时我们的实行还证实，K562细胞RNA刺激的树突状细胞及外泌体也可以直接诱导出对K562细胞的杀伤活性，提示白血病细胞外泌体也有作为疫苗用于白