浙液相色谱讲义三：分离方法离子抑制及离子对方法介绍

1、液相色谱的方法开发 （一）分离方法第一步干什么?想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法查文献，如CA(化学文摘)仪器制造商的文献，如Waters对色谱柱有足够的了解掌握分离机理，自己开发方法充分了解您自己的样品分析时要了解哪方面的情况？灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用? 分离时要了解哪方面的情况？要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成?一

2、般的具体步骤先用一根短的色谱柱用相对较高的流速使用尽可能纯度高的标准品先用高强度的洗脱液调节k 值改变保留值调节a值改变选择性调节柱长度改变柱效及分离速度使用文献方法色谱柱填料的种类、品牌是否相同?注意文献方法的流动相是否损害色谱柱?如色谱填料品牌不同，需要调整流动相注意色谱柱的规格：内径、柱长需要调整流速、进样量注意梯度条件了解系统的滞后体积（梯度）色谱方法转换如果没有与文献或要求相近的色谱柱转换进样量转换流速反相色谱的方法开发开发过程实例色谱条件色谱柱：C18，4mm30mm流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱流速：2ml/min样品： 对羟基苯甲

3、酸甲酯(Methyl Paraben) 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)改变容量因子 K谱图改变选择性a通过改变流动相改变选择性同样强度的不同溶剂改变色谱柱离子型化合物的分离方式使用离子交换柱离子交换法主要用于“强”阴、阳离子使用反相柱离子抑制色谱法通过改变流动相的pH值，使样品成中性离子对色谱法加入“对离子”，使样品呈中性离子抑制色谱离子型化合物在反相色谱柱上不保留改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离适用于弱酸性化合物的分离降低流动相的pH值，使样品降低离子化使用硅胶基质C18填料使用条件应在填料基质的范围内硅胶柱的pH在2-

4、8（较保险值3-7）内常用缓冲液及其pH值离子抑制色谱实例在乙腈/水及pH=7时，多数保留时间很短，无法完全分离。离子抑制色谱的使用范围如果：一些酸在pH低于2时还保持离子化一些碱在pH高于7时还保持离子化可以有以下的选择离子交换色谱使用聚合物反相柱，在pH高于7时用离子抑制法使用“离子对色谱法”在高pH值下用离子抑制色谱柱：D18-613(聚合物基质)，室温流动相：乙腈/0.01M NH4OH + 0.01M TBA流 速：1.0ml/min检 测：UV-240nm样 品：巴比妥的衍生物 巴比妥 己琐巴比妥 甲基苯巴比妥 速可巴比妥离子对色谱法在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂与样品中可电

5、离的组份形成“对离子”在反相色谱柱上分离离子型化合物离子对试剂的类型PIC A：磷酸季丁铵，适用于弱酸PIC B：烷基磺酸盐，适用于弱碱烷基长度不同，形成对离子的能力不同通常有：B5，B6，B7，B8PIC D4：磷酸二丁胺，适用于弱碱离子对色谱机理用离子对？还是离子抑制？ 抗组胺及减充血剂药物的分析离子对色谱的应用使用五烷基磺酸盐Packing: Bondapak C18Column: 4 mm ID x 30cmSolvent: Methanol/H2O with 0.005M PENTANE Sulfonic Acid & 1% HOAc (50/50)Flow Rate: 2.0 ml

6、/minDetector: UV, 254 nm, 0.1 AUFS1. Maleic Acid2. Phenylephrine3. Phenylpropanol- amine4. Naphazoline5. Phenacetin6. Pyrilamine 使用六烷基磺酸盐Packing: Bondapak C18Column: 4 mm ID x 30cmSolvent: Methanol/Water with 0.005M HEXANE Sulfonic Acid & 1% HOAc (50/50)Flow Rate: 2.0 ml/minDetector: UV, 254 nm, 0.1

7、 AUFS1. Maleic Acid2. Phenylephrine-HCl 3. Phenylpropanolamine-HCl 4. Naphazoline-HCl 5. Phenacetin6. Pyrilamine Maleate使用七烷基磺酸盐1. Maleic Acid2. Phenylephrine3. Phenylpropanolamine4. Naphazoline5. Phenacetin6. Pyrilamine Packing: Bondapak C18Column: 4 mm ID x 30cmSolvent: Methanol/Water with 0.005M HEPTANE Sulfonic Acid & 1% HOAc (50/50)Flow Rate: 2.0 ml/minDetector: UV, 254 nm, 0.1 AUFS样品浓度对分析的影响离子对色谱分析水溶性维生素用不同的离子对试剂离子对色谱 - 水溶性维生素方法开发的其他因素流速对柱效的影响不同内径的色谱柱有自己的最佳流速样品的进样量(浓度)对柱效的影响样品的进样体积对柱效的影响溶剂粘度对