低聚果糖分析方法及其检测标准的探讨

1、0 低聚果糖分析方法及其检测标准的探讨低聚果糖(fructo-oligosacchrides,FOS)又名蔗果低聚糖、寡果糖或蔗果三糖族低聚糖。近年研究发现，低聚果糖具有双向调节人体肠道微生态的功能，既能增加肠道内双歧杆菌的数量，又能同时抑制其他有害菌的生长1-4。而且低聚果糖很难被人体消化吸收,是一种低能量的糖,不会引起肥胖5。因此,低聚果糖成为近年来功能食品的研发热点之一。目前检测低聚果糖含量的方法主要有纸色谱分离法、气相色谱法和高效液相色谱法6,其中,高效液相色谱法最为简便和准确。但该法在实际使用中,包括国标规定的方法中,仍存在某些值得商榷的定性定量问题。本文拟根据我们的研究结果与经验就

2、这些问题进行初步的探讨。材料与方法1.1试剂与仪器乙腈(色谱纯)，美国天地公司；果糖、葡萄糖、蔗糖，纯度98%,美国Sigma公司；低聚果糖样品、超纯水实验室制备。FA1104电子天平，上海精天电子仪器厂；Waters600高效液相色谱仪，配Waters2414示差折光检测器，美国Waters公司；WaterssynaptUPLC-Q-TOF质谱仪，美国Waters公司。色谱条件色谱柱：WatersNH2分析柱(4.6mmX250mm,5pm)；流动相：乙睛水=70/30；流速：1.0mL/min；柱温：30C；进样量：10pLoUPLC-Q-TOF串联质谱条件(1)UPLC条件：色谱柱：Wa

3、tersNH2分析柱(4.6mmX200mm,3pm)；流动相：乙腈/水=70/30；流速：0.4mL/min；柱温：30C；进样量：2pL(2)Q-TOFMS条件：质谱采用电喷雾电离源(ESI)，TOF离子飞行方式采用V模式。四极杆质量扫描范围m/z1502000，一次扫描时间为0.1s，离子源温度100C，脱溶剂氮气流速400L/h。负离子电离模式，毛细管电离电压3kV,取样锥孔电压50V，碰撞能量分别为10和20V。结果与分析2.1三糖、四糖异构体的确证及其对检测影响由以上色谱条件测得低聚果糖色谱图如图1所示,根据标样的保留时间定性可知6.919min、7.539min和9.206min

4、对应的糖分别为果糖、葡萄糖和蔗糖，13.276min、17.927min、24.230min对应的物质分别为蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。那么蔗果三糖附近12.386min和14.672min的小峰是否可推测为三糖的异构体？同样，四糖附近的小峰是否也是四糖的异构体？为此，我们通过LC-MS-MS对这几个小峰进行了进一步的定性分析和确认。图1低聚果糖液相色谱图按1.3质谱条件，测得总离子流图和选择离子流图如图2,由质谱图(图3)可知，15.13min、16.36min、18.36min出峰物质以负离子方式扫描得到准分子离子峰M-H-m/z=503.1，这三种物质分子量均为504.1，和蔗果三糖的

5、分子量一致。22.65min、25.17min出峰物质以负离子方式扫描得到准分子离子峰M-H-m/z=665.2，这两种物质分子量均为666.2，和蔗果四糖的分子量一致。质谱分析的结果表明上述推测是正确的，在蔗果三糖附近的小峰确是三糖的异构体，蔗果四糖附件的小峰确是四糖的异构体。目前关于低聚果糖分析的文献，包括GB/T23528-2009，均未考虑异构体的含量；如此定量，无论是外标法还是归一化方法，其结果均会偏低。16.36min15.13min18.36min22.65min25.17min图2低聚果糖总离子流图和选择离子流图%,0%00图3各对应色谱峰的MS/MS图谱定量方法对低聚果糖检测

6、的影响在GB/T23528-2009“6.5.1原理”中指出：低聚果糖采用外标法或峰面积归一化法定量，以外标法为仲裁法。但在“6.5.4.2.3的注3”指出：由于果-果型3-6糖没有标样，以菊芋、菊苣为原料的低聚果糖含量计算宜采用峰面积归一化法。两处论述相互矛盾，以何为准？根据上述注3，以菊芋、菊苣为原料的低聚果糖计算含量采用峰面积归一化法。若聚合度均为10以下，用氨基柱分离，以乙腈/水为流动相，所有糖组分都可以出峰，即可以用归一化法定量。但若样品为菊粉，聚合度为2-60左右，在标准所述色谱条件下，聚合度较大的糖组分不能完全出峰，此时，用归一化法的结果会比实际含量高得多。另外，对于蔗-果型低聚

7、果糖，用外标法和归一化法的结果可能会相差较大，用外标法计算结果时，由于标样纯度、称重和进样体积误差等因素的影响，其重复性、重现性及准确性也会较差。检测器对低聚果糖检测的影响由于低聚果糖仅在低波长有较弱的紫外吸收，故GB/T23528-2009规定对其检测时选用示差折光检测器（RI）和蒸发光散射检测器（ELSD）。但若用ELSD检测，采用外标法计算时不能如该标准所述用6.5.4.3.1中式（1）计算。因为对于ELSD，糖组分浓度（质量）与峰面积不成线性关系，往往是取对数以后才近似成线性关系。同理，用ELSD检测时，也不可以用归一化法定量。讨论根据以上的分析，我们对GB/T23528-2009标准规定的低聚果糖检测方法有以下两点建议：对于蔗-果型低聚果糖和聚合度均小于10的果-果型低聚果糖，使用归一化法定量；对显著含有聚合度大于