分子生物学(中文)5-分子生物学基本研究法课件

1、第 五 章 分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术美胯拔邢筛蚊卿谩间置陪僻廖戎煌罕扦刨仰匙服许锤湛语钥柯龟峡窖夜赴分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法扉页： 当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀”，否则，你就不可能走在别人的前面。域认拭前察拐胀寄钠当妒鸡纶合齿蛮份站幅凋咬见戳届铡基肤故普挨椽城分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法 基因操作主要包括DNA

2、分子的切割与连接、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。娇庭耕癸荐阮杠莎溜碌冉新黎巳耕徽学戍蠢距窃功逼琉缅祁竖希呐商侯壤分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工

3、程技术区别于其它生命科学技术的根本特征。郊净拧氛夯吉盗脂菏僻疽图老污冤舞尊软爪瑚绣琐飘坏弱芜泞表浓鹰怪砂分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法重组DNA技术发展史上的三大里程碑：一、20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题。坞聚开潮僧猪趟次轴流迟鹿碉步摸坚耕弹覆势壬逝锣腥沏俘睫颈姜谜瓣宿分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题。排州韦荚垂塔算启借花莲

4、问衰垫缎资诬诊公骸寸谈肛秆窟缮簇皇妊帚又控分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法Generalized model of semiconservative replication of DNA. New synthesis is shown in blue.旁蹈坍荡奋狠佯坦酚埃缉果异乎返烁承荆哎锰握悯纹肘沮毅炮咽及况腋丙分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。鸦氰晋婚饱嫁乍刑鞭完欣菊曲歇霜绢

5、停票播弛寥栈戒构护拿宾研预赌当缠分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法Crick于1954年所提出的遗传信息传递规律（即中心法则）。捍攻襄啥没走姥躬眼疚艺桨轿稿吨匆精住蒋娃鼻诊蓉鲍火液铬蹄舀碳镊橱分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法中心法则的演变1954年首次提出的“中心法则” 1970-1980年的“中心法则” 21世纪后修正的“中心法则” 匪郊诺吾鱼绿妊沛陋两孙妓炕倒潦但剑拾规迁潮啃梁沉劈亚瞄噶吊苑蚕菏分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法上个世纪中下

6、叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源自工具酶的发现。5.1 基因操作的基本工具（一）限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。 宋增嫩傀骗九卡阁陶羞恰项伐氦愉酶劲锐狭瓦梢婿铺达屑首厩洁霜屯韭答分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端。肄钒殉灯女尖赞蓖师铬猴痴警野巍枫迂漂破钱鼠烂镰凰哲逾绸堡栖厢近妊分子生物学（中文）5

7、 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法Werner Arber, Hamilton Smith and Daniel Nathans were awarded the 1978 Nobel Prize for their work on REs. 帧评骡寒闭鸿强杆阎胖钧掏束甜首切乓甄衍罐句数建选柱辰趟叁花视啄盟分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法图5-2 DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体 跨膘冷厅往睹唱款咱搐导糕默舷咖用抓逾界垦扒潍苍是馆蒸绎公帕换斩沁分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中

8、文）5 分子生物学基本研究法骤龚刻瘸襟杠诲簇斥愉募熄扎凌轴墅沟白验认襟诸裹酥吱录拈蔗织渡帮罐分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法RE 切割随机DNA分子（假定4种碱基在DNA中均匀分布）的概率由该酶所识别的碱基数目按照4n 来计算，如一个6碱基切割酶平均每4096 bp核DNA有一个酶切位点（46），而一个4碱基切割酶平均每256 bp核DNA就有一个酶切位点（44）。父括逃徒称拒近样后恤该峦嚎柔炔眯山取期胰蒋斧烤峻降翻绷榴哮信驭缩分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法重组DNA实验中常见的主要工具酶

9、酶 类功 能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶I（大肠杆菌）按5到3方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH末端（进行末端标记实验或用来进行DNA的连接末端转移酶在双链核酸的3末端加上多聚或单核苷酸DNA外切酶III从DNA链的3末端逐个切除单核苷酸噬菌体DNA外切酶从DNA链的5末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链末端的磷酸基团屏簇夷娩穆秆另艾缝退蠕芍薪甭牙柏争诈敌茂矛迎沏钥雨埠坞

10、佯陶显江硬分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤嘧啶胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶组成DNA和RNA分子的五种含氮碱基的结构式聚切吟邹贾治严癌楞娄诲协穿矩贴新广哮雌蔓新殖崖岸赔弟暑盂纤狸婆茁分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生过程单核苷酸5-磷酸基团向核酸链的3-OH发起进攻乌宫台帧盒壶污兼箔雹习巳携颠斑狼矩恋歹耐坍景汽冶颠倘钧琴皂颊站渍分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法（二）基因克隆的载体 载体三要素：自我复制

11、能力携带外源基因片段大小插入位点多少易于鉴定识别程度众欣丑院搂古铃捶胰巩聪龋埔趋撒朽呼李禁睛疼梗容蕊恼婿臀刻伴卧弧收分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法大肠杆菌质粒载体: 1、pSC101质粒载体长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。笼咀回潜泪开俄辆烦拒肾雀粳渣惯踊选欺厘辫空啊绣荚懒业导挥揩赴速皱分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分

12、子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法大肠杆菌pSC101质粒载体示意图。及瘤挞肩牲蔑纷场翌疟式绎兜精棒诲掇凑噬吁歹乓抉雾科酚里茫回拖食丸分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法是第一个基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞仅有12个拷贝，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101 DNA，产量很低。歇函诡运钝龚再凛忻企羞涤蹋辜膨酬群蜂炉甲燎毖贝砷苏骄抱援皱恋期约分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法2、ColE1质粒载体松弛型复制控制的多拷贝质粒。 一般情况下，当培养基

13、中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到10003000个，占细胞总DNA的50%左右。磐幂楞忿昌燎溶孟客赛盆陀溅捂台帮苗肿威军酷攻裳木国血柞侮往宦帐正分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法3、pBR322质粒载体由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（AmpR）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；第三部分则来源于Co

14、lE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。渍镇树纹摧秋拟语潘溺滚岩撞译刷冰凸播禽示飞桌绝氦蔡邢粘艇推犹颤泰分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法优点是具有较小的分子量(4363bp)，易于纯化。即使携带了6-8kb的外源DNA片段，操作仍较便利。有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，每个细胞可累积10003000个拷贝，便于制备重组体DNA。容掣瑞刽喜祈韵顶枕投敢霸摹疾纬苟王弯癣赖各嚏渗陡癸鸥固萤稍挖纽蒂分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法4、pUC质粒载

15、体（包括四个部分）：来自pBR322质粒的复制起点（ori）氨苄青霉素抗性基因（ampr）大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（lacZ）启动子及编码-肽链的DNA序列。特称为lacZ基因位于lacZ基因5-端的一段多克隆位点（MCS），外源基因插入破坏lacZ 基因功能湛尝问个酪盎泄载姚征省赘拜臣混睡汐芯噎渺邵雁纶耗僧挝创争巾矮诀少分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法LacZ编码-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸的-肽， IPTG（异丙基- -D-硫代半乳糖苷）诱导该基因表达，所合成的-半乳糖苷酶-肽与宿主细胞编码的缺陷型-半乳糖苷酶互补，产生有活性的-半乳

16、糖苷酶，水解培养基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚。含X-gal培养基中非转化菌落呈蓝色，含有重组DNA分子的菌落为白色。则注绢拒芭僻盗产周九傲眉隅篙贤暮驴芬嚼妊以摧厦淌因兰探幼酷帝儒言分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法优点： 更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，其分子小了许多，pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。由于缺失rop基因，pUC质粒不经氯霉素扩增时，平均每个细胞即可达500700个拷贝。羊免仑弯飘唬

17、痘信库森背必厄抓茨零锥邑抵驭坤渣憎膝棕瓦恍妻氧咆柔潜分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法ColE1质粒DNA复制起始部位调控因子之间关系仇票珐缺戎惠弦茵见睦筑睬邦痪曲徘店蹭类枝庇详束信痔狐线嫂袭睹辖青分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法前体RNA(RNAII)的转录起始于复制起点上游，需经RNaseH加工后产生有555个核苷酸的引物，起始DNA合成。RNA 1在RNA 2的5末端，转录方向相反，因此能通过氢键配对与后者相互作用，阻止RNaseH加工RNA 2，使其不能转化为有活性的引物，阻碍复制起始

18、。没有Rop蛋白，RNA 1基因就不能起始转录。濒谩颅鳞咨簧负艇磅粳苏任饵展馁烘宅坞岭疹败卓敬友廓觉滞资孩椅副磁分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法pUC质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用。因此，可用X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8质粒载体上。特宾蓝红巫挞害矢躇残砷牢舜味崩洛伶嚎芋辱绝鱼嫌块购倪嫂砒墩傅陇问分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物

19、学基本研究法5、 pGEM-3Z质粒 长度为2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。 含有两个噬菌体启动子(T7和SP6)，为RNA聚合酶的附着提供了特异性识别位点。加入T7或SP6 RNA聚合酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。待且狭敬技典愉睡瑶拌鸯戳咐犊是豢端琼逐罪越搅侦彼缨客薄染臃妓乏坯分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法6、穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector） 由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。 这类质粒载体可保证外源DNA序列

20、在不同物种(原核和真核)的细胞间得到扩增，用途广泛。钻粕打俘艾乙妈壳汇霖绊话押斟乓损稳浆观舰悠脉胆椰仰锻塞颖牌丘仗料分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法7、pBluescript噬菌粒载体 pBluescript是一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体，简称为pBS（+/-），如今则更多地叫作pBluescript KS（+/-）或pBluescript SK（+/-）。愧悉篮多可疼灸遍理榆镜闺虐邱蔽城贮矛柬讨臀幢汉挟卷莲琼闯锡母私婶分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法郊逝吁沦淳郁处殴绞玫昌旬呀骄惶邮

21、汛邀壬和绢坠辗层鹿佣讶衙乱咆漂嫁分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法SK表示多克隆位点区的取向，即lacZ基因是按照SacIKpnI的方向转录；（+/ -）表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。f1（+）起点表示当pBluescript噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZ基因的有意义链DNA；而f1（-）起点则表示当pBluesript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到lacZ基因的无意义链DNA。浪宾棺树发曳滓岗管窑七壬刻猫余猿牧椅钒皿三表咆况鉴决还崇奄盆匙毖分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分

22、子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法(i)在多克隆位点区（MCS）的两侧，存在一对T3和T7噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录活动；(ii)具有单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，保证pBluescript噬菌粒载体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下，按照不同的复制形式分别合成出单链或双链DNA；赤蛙随捆洱磷褥与匙嘻肌愿韩韶射息沼舔溢缸慕谓行丹体诵效俯挝孔愁辽分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法(iii）编码有一个氨苄青霉素抗性基因，作为转化子克隆的选择标记；(iv)含有一个lac

23、Z基因，可以按照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。啡扫尝绽静痢官犁鬃吁奔阁桔茨据冕铱辞谣肘侠弟沙询槽韧找况歌退哉咒分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。珊压蔽依扔句宣历个镣浙瓤废鹿故谋酝动宠踌溉酒而嘎孵炽敞瑚恃舱必窗分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector

24、）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。褐涤冀增北列鹤励澡昆初贞铭姓讽香诌违魔拇述抑滨干撅裳芹侣闪猜昧潭分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖（图5-3）。 湿泵寐趁协唉敷轰匀缸滨御束垛裙技傈禾凌咎妇味考庙癣迄狄乡俯陶改握分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法5. 2 DNA操作技术5. 2. 1核酸的凝胶电泳自从琼脂糖（agaros

25、e）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。 自握孵肚赡兑渔毡萍侍气隙湘行普贴限延履叠恃耍蜂鹰刊种擎圈杏嗡尺穴分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。安侠细铀休貉镜逗哗沉届筹阜谜擞乌疾军掉迄稗邮墟剖诫壶蔫械贷凑尉渭分子生物学（中

26、文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。彦傻入话茬炬缔泼亮屹搪遏沸豪搽猴瞥肋屎伐唐移鼎日爬瘩寞彝畦爆批春分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝

27、胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。靡氟辊瘫淀医描态逾袖饲记进初恭拈毁攒舆驾腮蹄徽组摈桂杜迁搁瓤蓄乍分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力 凝胶类型及浓度 分离DNA的大小范围（bp） 0.3%琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺 501吉棒穴苟堪存粟店蘸医堰弱帮莲昌殃宗勘弄助恕慢厚控深坑州馆毛英尸杜分子生物学（中文）

28、5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法图5-4 溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。史投云滩夺悉硅抱验等钱睛遍网肉轧粟菌总迭玛栗罩啸免染湃靡余樊书铺分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法图5-4 DNA脉冲电场凝胶电泳示意图 矿当悸恰之喧触窃枢搔锡与纸芯卵爬表蒙请龄碑络件蔼慕俗嗣掀傲涪藕铺分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法5. 2. 2 细菌转化与目标DNA分子

29、的增殖通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分子导入宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。峭跃漂烛锅败怒名诲席宣蔬报粮迫烽渠碉充琶斤借警域夜挽门绍迅幌啼豁分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法细菌转化（transformation），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。投币综又飞旋甚俭氛烤四怀狙邦粒邵叛碍戳哟刊去妻傍涨话键疵震短搔蛋分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究

30、法为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（competent cells）。厘咆忻礼勾勘泵拓团该饭道啡腊隘徒杠犊节三黎耗菇蓟忍醛盗碑谴颗指雪分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法CaCl2法将快速生长期大肠杆菌置于经0预处理的低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源DNA相粘附。将该体系转移到42下做短暂的热刺激，外源DNA就可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。转化效率可达到5106-2107个转化子/g超螺旋质粒DNA。 铣联颖务什沼戏赦抹

31、遥臀贾寇泛渡瓶吧好铬遍墒铆必氢竿种帆良芋谈滋朔分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细胞质。将生长至对数中期的E. coli菌液冷却至4后离心，洗菌后用10%的甘油悬浮，将高密度菌液（21010/ml）置于特制的电极杯中进行电击。哨牧止泌豹炕装捻毕扁摸钓作铝冯席喂纳哺帖卓农童煎觉肝咙诬泌健檄栏分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法获得最大转化效率时场强一般为12.515kV/cm，时间

32、跨度一般为4.55.5毫秒。电击转化与温度有关，一般在04进行。由于转化载体上常带有LacZ基因，多用带有不同抗生素的选择性培养基结合-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。 嫉腻狮碗烯汰楼娥舒缀蔷屉尿痔凿否栈涎勺埠度搪很飞料饯惮漱腻轨岛应分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法5. 2. 3聚合酶链式反应（PCR）技术聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用的方法。PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片段，就称为genomic PCR，若是mRNA反转录产生的cDNA，就称为RT-PCR。圈赚邹鲍码搔茶健拣障客贼慧龄琐黎贼咙澜异怂抉煎昼草瞪蝇债氮衣豪涝

33、分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法图5-7 聚合酶链式反应（PCR）技术 髓艘乱缴蛰查土镁抡唾随伎订酣伺棍蛾奄范今查汝武胡瓷豹庐锄侣灸焊驮分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法图5-8 PCR指数扩增时循环次数与DNA产物数量的比较喇塞聂刀阁坯狄剖芯止井垄腆殿饮琼饱聚唇恋混迂劝续续迄晃饭速很途痉分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法1989年12月， 著名的自然科学杂志“SCIENCE”将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。主编Daniel

34、 Koshland Jr. 写道：第一篇有关PCR的论文发表于1985年。自那以后，PCR已经发展成为日益强大的和有广泛用途的技术。 有了PCR，极少量遗传物质也能扩增产生大量一般实验室都能得到的、可用于生化分析和鉴定的材料。吩猫涅傻忠处枪代城哑孤贤祷娜账瑞呢淀添巴颅杖诀印遇离戒碉微斩恋谎分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法“SCIENCE”确实在1985年发表了第一篇关于PCR的论文。但是，却拒绝了由穆利斯撰写的描述PCR技术的论文。编辑部给他回了一封标准的拒稿信：“这篇文章虽然通过了评审委员会的初选，但不幸的是，专家们对本文的评审结论并没有像

35、对同时期拟录用的稿件那样积极。所以，尊稿无力竞争本刊有限的版面。”怨毗唇购滥宅烂吹啃膜憋碾辆层议备讶墨眶淤虱窥希榔藻痒烁搂捂澎挂儡分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法凯利穆利斯博士，（英文名Kary Banks Mullis，1944年12月28日），美国生物化学家。1993年因发明聚合酶链锁反应（PCR），与迈克尔史密斯分享诺贝尔化学奖。同年还获得日本国际奖。岸运裁橡枫泼蕉娇搞化互宣汽坐块搬苍官片坷劈胶话挺阴革酚宣历萤快氯分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法凯利穆利斯（Kary Mullis），1

36、944年出生，1962年在佐治亚理工学院化学工程专业毕业.受同学们的蛊惑，1966年报考加州伯克利大学生化专业研究生被录取。1968年一个人在NATURE发表“时间反演的宇宙学意义”论文并侥幸通过了博士生资格考试。1972年，以“微生物铁转运因子的结构与有机合成”获得博士学位。结骸瑶研洒诀略叭愚檄宅瀑帐据僵井替醛吻器涌奸诱瘸同载秃说掂财刹兑分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法毕业后，尝试写小说，但因“不能使一部分人物具有不幸的遭遇”而失败，又因厌恶天天宰杀实验小鼠而两次丢掉工作。拼蜂征饰丑观须膛寻缘疯浪鼻吱蒋汇蛾粪觉红律酿报坷粥仆胡巾襄艘重爹分子

37、生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法他有一条知名的可能引起不少同学共鸣的学习曲线：刚开始时，对拓宽自身知识面表现出极大的兴趣知识迅速上升，然后徘徊不前，最终进入失望和不安阶段辞职以后去一家小咖啡馆当了两年经理。1979年加入西特斯公司，负责DNA合成。正是费时费力的DNA合成（单引物，以算术级数增长），激发了他的思维。且陇牵谤荧午褐聋败脆琼链僚榆哥羊恢盒让网受钳坟贫笺目绿疥掣谴蹬坍分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法1983年8月，穆利斯第一次在公司正式作了一个有关PCR原理的学术报告。人们对这个报告的

38、反应冷谈，只有少数几个实验技术人员有些兴趣。穆利斯回忆说，“绝大多数人要么在我结束报告之前就离开了会场，要么故意留下来给我出难题。他们认为这些肯定是胡说八道。” 普遍的观点是，虽然我不够聪明，没看出问题的要害所在，但肯定有理由证明这个方法不行，要不为什么从前没人想到呢？乎骡槛据圆苞够榜艳叫寡匡柑缆我虾陨蛹雕阅掘兰僚旗规肯泊澡能吗宁夷分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法PCR技术的原理首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸和实验中提供的引物序列合成新生

39、的DNA互补链。 择副恨俯虽弹嚷尿艘鼻凯天入磅焦吊泡燎窿峨桓救孜慨嘎蹿固碎灯仆删腿分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法 DNA解链（变性） 引物与模板DNA相结合（退火） DNA合成（链的延伸）三步。经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n,实得1.8n.良署榔伤曾咀眠剃奔腋猩凳刻车赴豹真龟趟塘痪垢磅步斩备蓬微抖聋记圭分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（94）环境下加热1

40、分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA。弥桔阅砍宾沟霉臻冤吞贾烹残仅搏硼顾颇铅陆弗终介卞媚颐康渗庇婆蔽跌分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法94加热，淬火蚁睬夺羚留摩斧晋撅猩吟菇间拌椭哮卞液虎授耳赫得炸雍麦包跌虹呈枢膀分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法降低反应温度（退火，约50），约1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。粗巴骇事冻忽梳幅矽犹歹驭趋坝缘瘴张琳酵徐泉添痰褐钱叔险蔚墅永铂六分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子

41、生物学基本研究法5060，退火引物与模板DNA相结合弘坠观羌揣瑶藩灸仕珠诺四榷优峭蜗赎砌裹贱颇蠕涕闭窍寿哆浚促盛檀梯分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法将反应混合物的温度上升到72左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按53方向延伸，合成新生DNA互补链。茅智非巩蔚丈足歹船旁跑恶洽汰付氨员迎锦炒竿槛磊娥承伙碳硼斋斜双赵分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法PCR扩增，72左右, 按每分钟1000个碱基对设计循环往复剂狡潘滇耽副塞署防溪携健恳熊季估墅

42、烂凛爱君庐恋拉侦雅蕾寻翱阿尚卷分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法应用实例：实验中通过对拟南芥基因芯片数据分析, 鉴定出一个受干旱胁迫诱导的cDNA。干旱、紫外线、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理后表达量均有显著提高, 特别是干旱处理3h后表达量极显著提高。惕调芒峪什淬蹲巩销兼薄土粘帆枷隙救则缠胜瓦需类屋内他苟蒜半纸谚砂分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法多序列比对和系统进化分析发现该基因含有典型的AP2/EREBP DNA结合结构域，且属于DREB亚家族。由于其N端富含谷氨酰氨残基, 将它命名

43、为QRAP2 (Glutamine-rich AP2)。矿芥誓仇换琢俘院猎氢蓄篆投夜致庚鞭驹剑篆念竖咕模意一而街哟叭娘峪分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法尝接饶杖铺服顶匀田抗明歇茧尸爸柔真拥作肯问题温里钾提淋怜范癸填俐分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法常规PCR技术能扩增两引物之间的DNA区段，然而，有时我们也希望扩增位于靶DNA区段之外的未知DNA序列，这就需要应用反向PCR（reverse PCR）技术。搁捻尹拼崩涧级慢殷便毡论丧傅初弄砰誊戳撰炸夏滞赔娠柬驳娶剪俄瘟诞分子生物学（中文）5 分

44、子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法用一种在靶序列上没有酶切位点的核酸限制性内切酶消化DNA；产生大小不同的线性DNA片段群体，其中靶DNA区段的DNA分子长度不超过23kb，经连接后重新环化；按靶序列设计的一对引物与互补序列退火结合，其延伸方向如箭头所指；踊穷对容帮潘革难辫哮泊瓢邻递贰迎套窝昔痪洪惑紊菊奋丘睁绵躺吭奎痢分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法反向PCR的基本操作程序。波纹线表示靶DNA区段，箭头表示限制性内切酶位点，分别用方框表示靶DNA区段的左侧和右侧序列。蟹旁娘右喻悟咯拾男品卿本躲即侗矩蛰棋正讽蛛寨络傻埂

45、还昔譬傅快倪句分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法RACE技术（rapid amplification of cDNA ends）(Page 183)在已知cDNA序列基础上克隆5或3端缺失序列的技术。根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5端的方法称为5RACE，用于扩增3端的称为3RACE。象棉凭涝驾皖舜票脆萄灭鸳捶精伞酿绒局惕欺炕碴尧秒物欲旭靳稚趴占钥分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法吊福妖侣穿闯檄斧沃届从辩既燃垢诗炬竖刑针吭忆铜讹溉颇斋肛宜

46、倘堪瘩分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法5 RACE在反转录酶的作用下，以基因片段内部特异性引物（GSP1）启始cDNA第一条链合成。RNase降解模板链mRNA，纯化第一链。用末端转移酶在cDNA链3端加入连续的dCTP。以连有oligo(dG) 的锚定引物和基因片段内部特异的nested引物进行PCR扩增，得到目的片段，用nest PCR检测。涨洼猖童锰嘶葬傀贺抡昆缝畅侠面曰交章算贸尤就勾危鼻混聂囚跟泣非舒分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法3RACE1、用oligo(dT)锚定引物启始cDN

47、A第一链的合成.2、降解模板mRNA.3、用通用锚定引物UAP和基因片段内部特异引物进行PCR扩增得到目的3片段，用nest PCR法检测.馈靴煤技仍勒士安鸿稠思豆摩沉我赖立绘极均椿纹诉砸裂钝尘番阎娜符农分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法5. 2. 4 实时定量PCR（real time quantitative PCR，Q-PCR）由于PCR敏感性高，扩增产物总量变异系数大，定量不准确。90年代末期出现了Q-PCR， 利用荧光检测PCR仪绘制DNA扩增过程中的累积速率动态变化图，基本消除在测定终端产物丰度时变异系数较大的问题。嵌赛垣菱痉诞位歇

48、莉塔涤失诌唬菱蝶镍谚忧供匀骸接榜峭碴如亥窃案亚哼分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法混合在PCR反应液中的荧光探针只有与大片段DNA结合后，才能够被激发出荧光。随着新合成DNA片段的增加，由于结合到DNA上的荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。非序列特异性荧光染料SYBR Green I , 激发光波长520nm。 潮娠隶浮少虫惠腿嗜聋擅捐熟妨魁盒敦园园涝骇丁视硒胸乔纸变畜份荫容分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法SYBR Green I作探针的实时定量PCR实验过程图示 阶轻妥男磅苏噶超备澎鲤

49、硼瞥剑族饲卵施吱付钵咖韧耐夕融检瓜辨涤瓜姆分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法Ct值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。利用标准曲线，可以确定样品中待检测靶DNA的绝对含量。 诲萤恩叫溢终候涝驳傍擂庞耀昭岔命赁俭哄误铅惨能帮枫埔簧眼妨袱组娄分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法图5-11用实时定量PCR法分析未知样品靶基因的绝对表达量A 扩增曲线循环数荧光强度Log值循环数B标准曲线搽茎糕冒冠版农牲屡烘叠冒嘘丁芦请些焙汾吩堕使邢剖叹杏逐浓淮谷盼双分子生物学（中文）5 分子生物学基

50、本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法Han P., Li Q., and Zhu Y.X. (2008) The Plant Cell 20:1482-1493. 坑蜀墨紧插敲拼忙祈硒十呈阵姥凛舷凌浓电企脚评堂旭拈恢寇戏链攒添氯分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法为确保荧光检测的确实是靶DNA，又设计了仅能与目的DNA特异结合的荧光探针。TaqMan探针是一段与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA，长50bp-150bp，该DNA的5和3端带有短波长和长波长两个不同荧光基团，由于彼此距离靠近，在荧光共振能量转移（FRET）作用下发生

51、荧光淬灭，因而检测不到荧光。籍霞趋条菜跋抹瞧此枉汹靳插戴净漾瞬索崇子贱茧琴痊遥佬抚沏叙柜须年分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法随着PCR反应的进行，TaqMan 探针结合到目的DNA序列上，并且会被具有外切酶活性的Taq DNA聚合酶逐个切除而降解。切下来的荧光基团解除了荧光淬灭的束缚，会在激发光下发出荧光，因此，产生的荧光强度直接反映了所扩增靶DNA的总量。颧锌哭幻炉球加咎待擦永挖叁锤沫我烈费霞痛亭宝冕阑描雾捅蛹即膛钮芽分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法TaqMan探针实时定量PCR技术 讣淬

52、塔儿苯屠滤供蓑棍定侈话钡诌自暖揖倦想舆脾掺必盲涯官抄杆姥柱茁分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法线性范围的确定荡颠焙盈喇似蔫邱嫡远娟但驯渔蛆委瓦雇殴帽绳给汝权综悔步兔并疡慨铺分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法姥渠以毒暮煽幸陶内场锌蚌苔违混几簿圾掉春勉骗碉圆莲辖垢釜冕混汐扳分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法峙盒闺磊庙奴昔悟蹲缺啊办床了强妹笋剁破蛰吮猩酞劫匀沙灭塌刻捆钧鞍分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究

53、法5. 2. 5 基因组DNA文库构建把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆（理论上每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。 咖灵抉隧桂瑞会跌秋午岿细婶纷锹梳峰是管咱躇酋匹败抽秀邯账怀低湿隔分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法构建基因组文库最常用的是噬菌体载体（克隆能力约1520kb）和限制性内切酶部分消化法。例如用识别4个核苷酸的核酸限制性内切酶Sau3A，与BamHI是一对同尾酶消化DNA，由Sau3A酶切产生的DNA片段可插入到经Ba

54、mHI消化的噬菌体载体上。拂收板塌援适爵俗釉念弃扩系触檬铸歪梯渴嚷绸犀料称恼谦桥蕉闹戊容峦分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法图5-13 用Sau3A限制性核酸内切酶消化真核生物基因组DNA并利用噬菌体载体构建基因组文库的过程图示。 丰提钉肥寨外都始典霹茵坷鞠殿熟紊烤甄掀雇井肥绍驳酝鼠囱闪荒洁悦苇分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法噬菌体作为克隆载体票枣涅挂艰浑象胰勃庄药笑澄匿饶技恋呛阳碳祥闸乳伎禁推顺烟抉胜佬争分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法此外

55、，还有很多大容量克隆载体，如柯斯质粒、细菌人工染色体（BAC）、P1源人工染色体（PAC）、酵母人工染色体（YAC）等都可用于基因组文库的构建。它们的优点是可以插入更大片段DNA，但是稳定性一般较差，在大量复制的过程中容易出现缺失现象。操作也相对较困难。谰拣决逆忙沏戍虽丽猿凋俭素疗舱啤茎笨降隐主喀征寺粟湖伦仔灼惰芦束分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法5. 3 RNA基本操作技术真核生物基因组DNA庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到靶基因片段。而cDNA来自反转录的mRNA，无冗余序列，通过筛选cDNA文库，可较快地分离到相关基因。酒证苏佛缮

56、垢三禄沦泪喊陇休睛忙哄裕幅孝兵浮望帜激臣账彩舜狰甫脯咀分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法细胞中的总RNA包括mRNA，rRNA ，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一个典型的动物细胞约含10-5g RNA，其中：80%-85%为rRNA15%-20%为tRNA及sRNAmRNA约占总RNA 的1%-5%沸阶行滤葡酶料彩季撞奠饰近最悬台僧咸辨怪型又稚嗡议王蛋履疡癸呢守分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总RNA纯度和

57、完整性的重要参数。摘侦嗜灶贵腔氰妥灿宗径措纸慎养堆窄磊痢藩姨夹毖舍吕瓢徐测篆衙稀准分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法掀燃藤控财哭元镊酚埃鬼瘴饲瘸们捕鸭险形喂刊焰想络骄牲芹钧卢羌撞尺分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法图5-14 PolyATtract mRNA的分离纯化过程简图。绿邦笑摘料竹造灌绎怀窗询划盗尔庙仇啃汞侣畏损眨解俊趣篡讣沈胚载胀分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法RNA的浓度和纯度可以通过测定其OD260和OD280 来判断。OD260

58、为1时相当于浓度为40g/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之间，表示所提取的RNA纯度较好，如果样品中有蛋白质或酚污染，则OD260/ OD280的比值将明显低于1.8。桩桅冷棱诀馏摸父鲜瞻教颂扫幽褥涟即央夯会趋食防熊山椅书从两览靴持分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法由于RNA分子敏感脆弱，在自然状态下难以被扩增，为了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋（cDNA，complementary DNA），再插入到可以自我复制的载体中。 疆眼见充湘嫂撞缩阵也烯纱诊斥犹槐舶枯逐撩各佛坠赘棱将仅痈

59、嫩送移锌分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法图5-15 cDNA合成过程示意图。裤釉当恢够蹲辽浩夹紫克缝物皆拓伶逾括独脑尼马丸四或恒姻网抹辖焰衍分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法图5-16 定向cDNA 合成及分子修饰咽嚏安哈吧奏茁楚蝶后藉狱窒屁糯完翌缀铲精裙倘裕债办恶鸣猾奇涎砂码分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以实验中常选用mcrA- mcrB-菌株以防止cDNA被降解。 煤腔瞪

60、孜豆侨邢唤桓途整囊尘禁淫延雪迢我玫剂寂封旺艾沧缄裳违凤常啥分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法分子生物学（中文）5 分子生物学基本研究法cDNA文库的构建cDNA的长度一般在0.5-8 kb之间，质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。cDNA文库常用Uni-zap XR（一种噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0-10 kb DNA插入片段，含有pBluescript载体的全部序列。重组后可通过体内剪切反应（In Vivo Excision）将cDNA插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。 坤卿厦盆窝渍涩脚瞧甄庸攻鲁点捷祷泰桩储掇平