吖啶橙提高葡萄糖氧化酶生物电催化活性作用研究

1、PAGE 吖啶橙提高葡萄糖氧化酶生物电催化活性作用的研究看看正文中的部分数字字母摘 要 电化学生物传感器的发展是目前分析研究中最活跃的领域之一。由于其具有灵敏度高、选择性好、响应快、操作简便、样品需要量少、可微型化、价格低廉等特点而广泛的应用于医疗保健、食品工业、农业以及环境等领域。葡萄糖氧化酶（GOx）的特点决定了其成为生物传感器及生物燃料电池等生物电子器件中使用最广泛的酶之一。但葡萄糖氧化酶在水溶液中不太稳定，并且易受外界环境干扰而丧失活性。因此采用合适的固定技术将葡萄糖氧化酶固定在载体上成为生物电子器件研究的关键步骤，将直接影响酶电极的灵敏度、稳定性以及酶的活性与寿命等。本课题使用有机染

2、料吖啶橙(AO)与葡萄糖氧化酶物理共吸附法将葡萄糖氧化酶固定于炭毡(CF)电极上（GOx/AO-CF），对吸附时间、葡萄糖氧化酶浓度、吖啶橙浓度、吸附液pH值、吸附液浓度、电解质溶液pH值等实验条件进行了优化与分析。与葡萄糖氧化酶单独吸附的炭毡电极(GOx-CF)比较，GOx/AO-CF电极展现出了优越的电化学性质。所制得的电极具有良好的操作稳定性，在使用葡萄糖进行连续10次测试中，电极的RSD%在4%以下。使用相同条件制备的三块炭毡电极，对葡萄糖进行测试，三块电极的RSD%为5%，因此我们认为应用此方法对炭毡电极进行固定具有很好的重现性。此外，将该电极储存在4度的环境中，一个月后该电极仍保持

3、了初始活性的XXX。关键词：葡萄糖氧化酶；吖啶橙；炭毡；物理吸附；电催化活性The research on acridine orange-induced enhancement effect of glucose oxidase for bioelectrocatalytic activityAbstractThe development of electrochemical biosensor is one of the attractive fields in analysis research. It is widely applied in clinical, food indust

4、ry, agriculture and environment because of its good characteristics such as high sensitivity, good selectivity, easy operation, small amount sample, miniaturization and cheap. Glucose oxidase (GOx) is the most popular enzyme which applied in biosensor and bio-fuel cell for its good character. But it

5、 is unstable in water and easy to denature because of the outer unfavorable condition. The proper immobilization method is the key procedure for GOx electrode which directly influencing the characteristics of electrode. We immobilized GOx on the carbon felt surface by the physical co-adsorption with

6、 acridine orange (AO). The adsorption time, GOx concentration, AO concentration, adsorption solution pH, adsorption solution concentration and electrolyte solution pH were optimized in this research. The GOx/AO-CF showed good performance as compared with GOx-CF. The RSD% of electrode is less than 4

7、after 10 times measurement by using D-glucose. The reproducibilities of three GOx/AO-CFs were prepared through the same conditions. The RSD% is 5 by using D-glucose. Then we can evaluate that it has good reproducibility by using this method. And the electrode still kept Xx of the initial activity af

8、ter 1 months keeping in the 4 in refrigerator.Keywords: glucose oxidase；acridine orange；carbon felt；physical adsorption；bioelectrocatalyltic activity目录 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc327005230摘 要 PAGEREF _Toc327005230 h I HYPERLINK l _Toc327005231Abstract PAGEREF _Toc327005231 h II HYPERLINK l _Toc

9、3270052321. 绪论 PAGEREF _Toc327005232 h 1 HYPERLINK l _Toc3270052331.1生物传感器 PAGEREF _Toc327005233 h 1 HYPERLINK l _Toc3270052341.1.1生物传感器介绍 PAGEREF _Toc327005234 h 1 HYPERLINK l _Toc3270052351.1.2电化学生物传感器介绍 PAGEREF _Toc327005235 h 1 HYPERLINK l _Toc3270052361.1.3电化学生物传感器应用 PAGEREF _Toc327005236 h 2 H

10、YPERLINK l _Toc3270052371.2 生物传感器固定方法 PAGEREF _Toc327005237 h 2 HYPERLINK l _Toc3270052381.2.1 吸附法 PAGEREF _Toc327005238 h 2 HYPERLINK l _Toc3270052391.2.2 共价偶联法 PAGEREF _Toc327005239 h 3 HYPERLINK l _Toc3270052401.2.3 化学交联法 PAGEREF _Toc327005240 h 3 HYPERLINK l _Toc3270052411.2.4 物理包埋法 PAGEREF _Toc

11、327005241 h 3 HYPERLINK l _Toc3270052421.3炭毡介绍 PAGEREF _Toc327005242 h 4 HYPERLINK l _Toc3270052431.4 葡萄糖氧化酶及其应用 PAGEREF _Toc327005243 h 4 HYPERLINK l _Toc3270052441.5 吖啶橙介绍 PAGEREF _Toc327005244 h 5 HYPERLINK l _Toc3270052451.6课题的内容及意义 PAGEREF _Toc327005245 h 5 HYPERLINK l _Toc3270052462.实验部分 PAGER

12、EF _Toc327005246 h 7 HYPERLINK l _Toc3270052472.1仪器和试剂 PAGEREF _Toc327005247 h 7 HYPERLINK l _Toc3270052482.1.1仪器设备 PAGEREF _Toc327005248 h 7 HYPERLINK l _Toc3270052492.1.2 试剂 PAGEREF _Toc327005249 h 7 HYPERLINK l _Toc3270052502.2 实验方法 PAGEREF _Toc327005250 h 7 HYPERLINK l _Toc3270052512.2.1 炭毡的准备 P

13、AGEREF _Toc327005251 h 7 HYPERLINK l _Toc3270052522.2.2 吸附液的配制 PAGEREF _Toc327005252 h 7 HYPERLINK l _Toc3270052532.2.3 电解质溶液的配制 PAGEREF _Toc327005253 h 8 HYPERLINK l _Toc3270052542.2.3 葡萄糖溶液的配制 PAGEREF _Toc327005254 h 8 HYPERLINK l _Toc3270052553.结果与讨论 PAGEREF _Toc327005255 h 9 HYPERLINK l _Toc3270

14、052563.1 催化反应机理 PAGEREF _Toc327005256 h 9 HYPERLINK l _Toc3270052573.2 GOx/AO-CF的循环伏安曲线图 PAGEREF _Toc327005257 h 9 HYPERLINK l _Toc3270052583.3 吸附液pH值考察 PAGEREF _Toc327005258 h 10 HYPERLINK l _Toc3270052593.4 吸附时间考察 PAGEREF _Toc327005259 h 11 HYPERLINK l _Toc3270052603.5 电解质溶液pH值考察 PAGEREF _Toc32700

15、5260 h 12 HYPERLINK l _Toc3270052613.6葡萄糖氧化酶浓度考察 PAGEREF _Toc327005261 h 13 HYPERLINK l _Toc3270052623.7 吖啶橙浓度考察 PAGEREF _Toc327005262 h 14 HYPERLINK l _Toc3270052633.8 吸附液浓度考察 PAGEREF _Toc327005263 h 15 HYPERLINK l _Toc3270052643.9 GOx/AO-CF工作电极的重现性 PAGEREF _Toc327005264 h 16 HYPERLINK l _Toc327005

16、2653.10 GOx/AO-CF工作电极操作稳定性考察 PAGEREF _Toc327005265 h 17 HYPERLINK l _Toc3270052663.11 GOx/AO-CF工作电极储存稳定性考察 PAGEREF _Toc327005266 h 18 HYPERLINK l _Toc327005267结 论 PAGEREF _Toc327005267 h 19 HYPERLINK l _Toc327005268致谢 PAGEREF _Toc327005268 h 21 HYPERLINK l _Toc327005269参考文献 PAGEREF _Toc327005269 h 2

17、21. 绪论1.1生物传感器1.1.1生物传感器介绍生物传感器由分子识别部分（敏感元件）和转换部分（换能器）构成，以分子识别部分去识别被测目标，是可以引起某种物理变化或化学变化的主要功能元件。生物传感器是一类特殊的化学传感器，它是以生物活性单元（如酶、微生物、动植物组织切片、抗原和抗体、核酸等）作为生物敏感基元，对被测目标具有高度选择性的检测器。它通过各种物理、化学型信号转换器捕捉目标物与敏感基元之间的反应，然后将反应的程度用离散或连续的电信号表达出来，从而得出被测物浓度1。根据生物传感器中分子识别元件即敏感元件可分为五类：酶传感器，微生物传感器，细胞传感器，组织传感器和免疫传感器。根据生物传

18、感器的换能器即信号转换器分类有：生物电极传感器，半导体生物传感器，光生物传感器，热生物传感器，压电晶体生物传感器等。生物传感器是生物反应技术与传感技术有机结合的产物。它具有以下优点：（1）高选择性、高感度；（2）操作简单、测量迅速；（3）不受样品量的限制；（4）样品无需预处理，可直接测定；（5）固定的酶可以反复使用，价格低廉。1.1.2电化学生物传感器介绍电化学生物传感器是指以电化学电极(固体电极、离子选择性电极、气敏电极等)作为信号转换器，以电化学参数(电势、电流或电容)为特征检测信号的生物传感器。在许多的生理反应中都涉及到电子的传递(氧化还原反应)，电化学生物传感器作为最早开发研究的一类生

19、物传感器，引起了人们的广泛兴趣2-6。按照所获取的电化学信号的不同，可以分为电位型传感器、电流型传感器、电导型传感器、电容型传感器等。电位型传感器将生物识别性反应转化为电位响应信号，一般来说，电位响应信号与生物识别反应中消耗或产生的活性物质浓度对数成正比，因此其一般也与待测物质浓度的对数成正比。电流型传感器主要通过探测电化学反应或生物识别反应中电活性物质的变化，通过对工作电极施以一定的电位，从而给电活性物质的电子转移提供驱动力，获得电流信号的变化，因为电流直接反映了电子转移反应的速度，反映了生物分子识别的速度，因此电流信号与待测物质的浓度成正比。电流型生物传感器由于具有较宽的线性范围以及高灵敏

20、度，引起人们的广泛关注7。1.1.3电化学生物传感器应用生物传感器被广泛的应用于很多领域。在食品工业中，它可以用来检测食物中葡萄糖的浓度；检测食品添加剂等化学成分的含量；也可以对食品中的农药残留情况进行检测。在环境监测领域中，随着水源地污染问题日益严重，建立和发展安全、在线、快速的现场监测体系尤其重要。电化学生物传感器与传统的分析技术相比，具有体积小、成本低、选择性好、灵敏度高、响应快等优势，特别是无二次污染，适用于水源地水质进行快速在线连续预警监测，在环境监测领域有着广阔的应用前景。它可以用来检测土壤或者水中的污染物如酚类化合物、氰化物等8。葡萄糖氧化酶最广泛的应用还是在于医疗领域，例如血糖

21、仪是最早应用于医疗领域的传感器之一。生物传感技术不仅为基础医学研究及临床诊断提供了一种快速简便的新型方法，而且因为其专一、灵敏、响应快等特点，在军事医学方面，也具有广泛的应用前景。未来发展趋势在于：从实验室走向商品化的进程加速；在水质监测中的应用将会进一步拓宽；由单一功能的生物传感器向多功能生物传感器发展；和其他精密仪器相结合，取长补短；生物传感器向微型化、集成化、智能化方向发展9。1.2 生物传感器固定方法在生物传感器的制备中，一个关键技术就是如何将生物活性成分稳定、高活性地固定到换能器表面，构建生物传感器的敏感识别部分(生物敏感膜)，这将直接影响到生物传感器的测定重复性、灵敏性、线性范围、

22、检测限及使用寿命等。常用的生物活性成分的固定方法有以下几种：1.2.1 吸附法吸附法又分为物理吸附和化学离子交换吸附。物理吸附是通过氢键、疏水键和静电吸附力等物理作用将生物成分固定于不溶性载体的方法；离子交换吸附是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用生物分子的侧链解离基团和离子交换的相互作用而达到生物活性成分固定化的方法。物理吸附具有无需化学试剂、极少的活化和清洗步骤，同其他化学法相比，很少发生生物分子降解，对生物分子活性影响较小等优点。但对溶液的pH变化、温度、离子强度和电极基底比较敏感，需要对实验条件进行相当程度的优化，此外，该方法还由于生物组分易从电极表面脱落，因此不易于应用，而且同其他

23、固定技术相比，生物组分的寿命比较短7。1.2.2 共价偶联法共价偶联法是借助共价键将生物组分的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行共价偶联以固定生物分子的方法。由于需要较好地保持生物组分的活性，通常要求在低温(0)、低离子强度和生理pH条件下进行，并常加入对应的底物以防止活性部位与电极表面发生键合。共价偶联法的特点是结合牢固，生物分子不易脱落，载体不易被生物降解，使用寿命长，缺点是操作步骤较麻烦，活性可能因化学修饰而降低，制备高活性固定化生物组分较困难，多用于酶膜和免疫膜的制作。但通常需要多步骤操作，需要对电极进行预活化7。1.2.3 化学交联法 化学交联法是利用双功能或多功能试剂在生物分子

24、与载体间、或生物分子与惰性蛋白间进行交联反应以制备固定化生物组分的方法，例如用戊二醛加牛血清蛋白交联葡萄糖氧化酶。交联法广泛用于酶膜和免疫膜的制备，操作简单，结合牢固。但是这种方法的主要缺点是生物膜与换能器表面结合力不强，固定的稳定性差。此外，实验过程中需要使用化学试剂，易对环境造成污染7。1.2.4 物理包埋法将酶包埋在凝胶的细微格子里制成固定化酶。根据包埋方式不同，包埋法可分为生物材料整体包埋和表面膜包埋法。整体包埋主要应用于电化学生物传感器制备中，将生物分子(酶、抗体等)、导电材料以及粘结剂一起混合均匀，形成导电复合材料，压至特制的管材中，并形成电连接，便获得生物材料修饰电极；表面膜包埋

25、法则是用特定的膜将生物材料固定在换能器表面，获得生物敏感膜，可利用的膜材料较多，包括水凝胶、LB膜、溶胶凝胶膜以及各种电聚合膜等。膜包埋一般不涉及对生物材料化学处理，所以，对固定生物材料活性影响较小，同时，膜的孔径和几何形状可以适当调控，有利于底物分子及电子媒介的穿透。由于有广泛可得的成膜材料，因而使得膜包埋技术成为生物材料固定的主要方法。但膜的生物相容性、稳定性、膜与换能器表面的粘结性等，是膜包埋技术中常遇到的问题。因此，致力于改进膜的性能，延长生物传感器的使用寿命，仍是目前生物传感器研制中的热门研究领域7。1.3炭毡介绍炭毡是一种碳纤维，直径约为7微米，它具有自由无序的三维结构。炭毡拥有高

26、表面积、高导电性及高电子效率。并且由于其具有高孔隙(90%)而作为电极应用于流动注射系统中8。根据这些特点,CF已经采用了氧化还原流电池,10电化学水净化11、快速库仑滴定法12、生物燃料电池13、生物传感器14。因此,在CF表面建立有效的固定化酶对发展基础电化学CF生物传感器、生物反应器、生物燃料电池有很大的价值。最近报道,过氧化物酶吸附CF电化学探测器进行水15,16和氰化物的测试17。在这种情况下,被吸附的酶比较稳定并表现出足够的生物电催化活性、操作性和储存稳定性。因此,如果对CF的物理吸附法可广泛用于其他酶类，那么其应用适用性也许是可以期待的。1.4 葡萄糖氧化酶及其应用由黑曲霉发酵制

27、得的葡萄糖氧化酶（GOx）是一种需氧脱氢酶，能够在氧气的存在下催化氧化D-葡萄糖，释放过氧化氢。它是一个碳水化合物含量约为16%的同型二聚体18,19。葡萄糖氧化酶中包含两个非共价键结合却紧紧相连的黄素腺嘌呤二核苷酸（简称FAD），FAD是葡萄糖氧化酶的活性中心，使酶具有氧化还原特性20,21。它在水溶液中一般不太稳定，易降低甚至丧失其活性。化学物质如强酸、强碱、尿素、有机溶剂等会引起酶的失活；加热、紫外线以及超声波等物理作用同样会使酶变性，使其丧失生物活性。有时酶的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。葡萄糖氧化酶结构的不稳定性，使其应用受到限制22。葡萄糖氧化酶的特点决定了其成为生物

28、传感器及生物燃料电池等生物电子器件中使用最广泛的酶23-25。在食品工业中，含有黄酮、亚油酸、亚麻酸等还原性物质的食品，如果汁、茶饮料、葡萄酒、啤酒、蛋黄酱、果酱等，存在氧会使还原性物质氧化，致使产品浑浊、沉淀、变色。加入适量GOx或GOx-过氧化氢酶复合物，可有效地保护食品中的还原性物质；由于葡萄糖氧化酶能够专一性的催化氧化葡萄糖，因此用来检测食品中的含糖量。葡萄糖氧化酶最重要的应用是在医疗诊断上，用来检测血液、血清及血浆中的葡萄糖含量。传感器领域中，葡萄糖传感器的占有率高达85%。除了食品工业与医疗诊断外，葡萄糖氧化酶还广泛的应用于环境监测等领域，葡萄糖传感器都起到了很重要的作用26。此外

29、，随着不可再生能源的大量开采，面临枯竭，可再生能源越来越受到重视。生物燃料电池能量转化效率高27、生物相容性好、原料来源广泛、可以用多种天然有机物作为燃料，是一种真正意义上的绿色电池。它在医疗、航天、环境治理等领域均有重要的使用价值，如糖尿病、帕金森氏病的检测、辅助治疗28,29以及生活垃圾、农作物废物、工业废液的处理等。同时生物原料储量巨大、无污染、可再生，因此生物燃料电池产生的电能也是一个潜力极大的能量来源。1.5 吖啶橙介绍图1.1 吖啶橙结构式吖啶橙(Acridine Orange,AO) 是一种三环芳香类阳离子型的碱性荧光染料，常用于细胞内DNA的定量测定及活细胞染色，与蛋白质或者酶

30、结合后，其荧光光谱会发生改变。据文献报道，酶与小分子有机染料可以在适当的条件下通过非共价键相结合形成的超分子化合物和染料本身相比在吸收光谱及光吸收程度上有着明显的变化，以此为基础建立了许多酶光度分析的方法。童沈阳30,31的研究小组用分光光度法研究了小分子物质和蛋白质相互作用的机理并用于分析测试，考察了不同类型的表面活性剂对结合反应的影响，但文献多以荧光光度法或分光光度法为检测方法，尚未见用电化学分析方法研究染料与酶相互作用的报道。1.6课题的内容及意义本课题以对苯二酚为电子传递介体研究第二代生物传感器，针对物理方法固定酶的不足例如酶与电极结合不牢固、易脱落，酶易受电极表面影响而失活，酶电极稳

31、定性低，重复使用性差等缺点，提出了使用吖啶橙物理共吸附法将葡萄糖氧化酶固定在炭毡电极上，实验操作过程简单易行，不使用有机溶剂，降低环境污染程度。所得的电极具有优异的生物电催化活性。因此，吖啶橙能够提高葡萄糖氧化酶的生物催化活性及电催化活性。本课题的研究克服了物理吸附方法固定电极中酶的不牢固、易脱落，电极稳定性差、重复性低等缺点。对于研究酶的生物活性及电化学活性的研究都具有重要意义。对于日益发展的生物电子学信息科学与生命科学的前沿交叉领域，本课题对于开发葡萄糖氧化酶传感器以及葡萄糖氧化酶燃料电池都具有一定的理论及实际意义。本研究将为葡萄糖氧化酶进一步实际应用奠定了重要的基础。2.实验部分2.1仪

32、器和试剂2.1.1仪器设备LK2005A型电化学工作站 （天津市兰力科化学电子高技术有限公司）KQ-100E超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）PHS-3D pH计 （上海精密科学仪器有限公司）85-1B磁力搅拌器 (巩义市予华仪器有限公司)2.1.2 试剂1. 葡萄糖氧化酶 日本和光纯药工业株式会社2. 吖啶橙（ 014-08941） 日本和光纯药工业株式会社3. 氢醌 日本和光纯药工业株式会社4. 乙酸 （10000218） 国药集团化学试剂有限公司5. 磷酸 （20015418） 国药集团化学试剂有限公司6. 硼酸 （10004818） 国药集团化学试剂有限公司7. 氢氧化钠 （10

33、019762） 国药集团化学试剂有限公司9. 葡萄糖 （10010518） 国药集团化学试剂有限公司9. 二次蒸馏水 玻璃仪器有限公司2.2 实验方法2.2.1 炭毡的准备切一块10mm x 3mm x3mm 的炭毡，重量大约为12-13mg之间。将炭毡浸泡于二次蒸馏水中，超声波清洗10分钟，待用。2.2.2 吸附液的配制以冰醋酸、磷酸、硼酸三种酸，配制混合酸的溶液，再配制氢氧化钠溶液，将两种混合配制成不同pH值的Britton-Robinson（BR）缓冲溶液。缓冲溶液的浓度分别为1mM， 5mM，25mM，50mM，100mM。2.2.3 电解质溶液的配制同上步骤配制100mM的BR缓冲溶

34、液，称量0.0028g的对苯二酚，加入100mL100mMBR缓冲溶液，配制0.25mM对苯二酚溶液。2.2.3 葡萄糖溶液的配制以2.2.2中配制的100mM BR缓冲溶液为溶剂，配制2M 葡萄糖溶液。3.结果与讨论3.1 催化反应机理图3.1 炭毡工作电极中葡萄糖氧化酶的催化反应机理很多氧化还原活性物质，例如对苯二酚，对苯醌，二茂铁衍生物，多巴胺以及吩噻嗪类化合物等可以取代氧气而被作为电子受体。由于实际样品中的溶解氧气的浓度难于测定且不稳定，从实际角度出发，上述的电子受体通常被用作电子传递介质而应用于第二代葡萄糖氧化酶传感器中。本研究以氢醌为电子传递介质，具体催化反应机理由图3.1所示。对

35、苯二酚 对苯醌 + 2H+ + 2e- (1)GOx(FAD) + D-葡萄糖 GOx(FADH2) + D-葡萄糖酸-内酯 (2)GOx (FADH2) + 对苯醌 GOx (FAD) + 对苯二酚 (3)3.2 GOx/AO-CF的循环伏安曲线图图3.2所示为葡萄糖氧化酶单独吸附电极（GOx-CF）与葡萄糖氧化酶/吖啶橙共同吸附电极（GOx/AO-CF）的循环伏安曲线。当葡萄糖氧化酶被单独固定在炭毡表面时，吸附的葡萄糖氧化酶几乎没有电化学活性，这可能是由于吸附所导致的葡萄糖氧化酶在炭毡电极上发生不利的构象改变或吸附方向改变而使得酶部分失活。相比之下，当葡萄糖氧化酶与吖啶橙共吸附于炭毡表面时

36、，GOx展现了很好的生物电催化活性。图3.2 两种电极的循环伏安曲线（GOx=0.1mg/mL; AO=0.4mM;HQ=0.25mM; 黑色：葡萄糖60mM；灰色：葡萄糖0mM）3.3 吸附液pH值考察吸附液的pH值对于酶的活性具有很重要的影响。因此我们考察了吸附液的pH值对葡萄糖氧化酶炭毡工作电极电催化性能的影响。分别考察了电极在吸附液的pH为3,4,5,6,7,8,9时所产生氧化电流的情况。如表3.1所示，葡萄糖氧化酶单独吸附的工作电极随着吸附液pH值的增加，催化电流也随之增加。随着碱性增强，溶液中的负离子能够与酶的正离子通过静电引力作用而使酶的结构更稳定。由表3.1做图3.3，在葡萄糖

37、氧化酶与吖啶橙（AO）的吸附液中，随着pH值的增加，催化电流没有一直增加，形成了一条曲线，在pH值为5时达到了最大值。根据文献报道，葡萄糖氧化酶的等电点大约在4.2左右，是含有大量负电荷的酶。而吖啶橙是带有正电的有机染料。而其他研究表明，在pH5左右时，葡萄糖氧化酶的吸附量达到了最大值。此外，酶与吖啶橙之间通过静电引力作用结合，能够阻止酶在炭毡表面由于疏水作用而导致部分失活。葡萄糖氧化酶的最佳工作pH值在5.6左右，由图3.3所示，实验测得pH值为5时，葡萄糖氧化酶电极的催化电流为最大。此结果与文献报道符合。表3.1 两种工作电极在不同pH值下的催化电流对比这个是三线表吗，好像不对啊pH值34

38、56789催化电流（A）GOx-CF2.1110.0614.8124.3744.4458.7789催化电流（A）GOx/AO-CF62.13166.48226.71223.94177.37160.13127.86图3.3 吸附液pH值变化（黑色为葡萄糖氧化酶-吖啶橙电极；白色为葡萄糖氧化酶电极；葡萄糖40mM。）3.4 吸附时间考察图3.4 （由表3.2作图所得）所示的数据为工作电极吸附时间的考察，将清洗后的炭毡电极浸没于GOx-AO混合溶液中，我们考察了吸附时间为5分钟，30分钟，1小时，3小时，6小时以及12小时的条件。实验结果表明，在1小时的吸附时间情况下，我们得到了最好的结果，吸附时间

39、过长不仅无法提高葡萄糖氧化酶的催化活性（由图可知），而且还浪费工作时间，因此我们选用1小时为优化时间。表3.2 工作电极吸附时间优化吸附时间（h）0.08250.513612催化电流（A）56.4150.4217.8180.8169.2116.6图3.4 GOx/AO-CF吸附时间的优化3.5 电解质溶液pH值考察我们使用对苯二酚作为电子传递介质，讨论电解质溶液的pH值对实验结果的影响。根据文献表明，葡萄糖氧化酶的最佳工作pH值在5.6左右，强酸、强碱的情况下都容易使葡萄糖氧化酶失活，表3.3为葡萄糖浓度为40mM时的GOx/AO-CF电极的氧化电流，当电解质溶液在pH5.5时得到了最好的实验

40、结果。这一结果与文献值符合，因此在之后的实验均使用pH5.5的BR缓冲溶液作为电解质溶液。由表3.3作图，见图3.5。表3.3 电解质溶液pH值的优化pH值3.544.555.566.578催化电流（mA）106.0245.5314.4351.9436.3380.9316.2244.0195.1图3.5 电解质溶液优化条件3.6葡萄糖氧化酶浓度考察我们考察了葡萄糖氧化酶的浓度对实验结果的影响。从表3.4的实验结果可以看出，在葡萄糖氧化酶为0.1mg/mL之前，电流值随着葡萄糖氧化酶浓度的增加而增大；之后电流值又随着葡萄糖浓度的增大而减小。在我们之前的研究中，也曾出现过类似情况33。原因如下：0

41、.1mg/mL之前由于葡萄糖氧化酶吸附量的增加而使得氧化电流增大；但是在0.1mg/mL之后，随着葡萄糖氧化酶吸附量的增加，由于炭毡表面的吸附量有限，使所有葡萄糖氧化酶不能完全展现其活性，因此再提高葡萄糖氧化酶的浓度，工作电流值反而是越来越低，同时还浪费了大量的葡萄糖氧化酶，因此选定0.1mg/mL的葡萄糖氧化酶为最佳浓度值。由表3.4作图如下，见图3.6.表3.4 葡萄糖氧化酶浓度优化GOx浓度（mg/mL）0.010.020.050.10.1250.20.250.40.5催化电流（A）65.01119.67304.99327.93288.96252.94190.72141.95128.88

42、图3.6 葡萄糖氧化酶浓度优化3.7 吖啶橙浓度考察吖啶橙是吖啶类的带有正电的有机染料，因此能够与带负电的葡萄糖氧化酶通过静电引力作用结合。结合后使葡萄糖氧化酶结构更加紧凑，能够有效防止其在炭毡表面由于疏水基等作用而导致的部分活性丧失。我们对吖啶橙浓度进行了优化，如表3.5所示，当吖啶橙浓度为0.3mM的时候，工作电极呈现出最高的活性。由表作图为3.7。在此后的实验中，我们使用吖啶橙的0.3mol/L为最佳浓度。表3.5 吖啶橙浓度优化吖啶橙浓度（mM）0.10.20.30.40.5催化电流（A）356.45580.43779.19668.53669.67图3.7 吖啶橙浓度的优化3.8 吸附

43、液浓度考察酶复杂的三维结构能够被一些非共价键作用所稳定，例如氢键、范德华力、静电引力以及疏水作用等。其中一个很重要的作用是静电引力作用。因此，溶液中的离子强度对于稳定葡萄糖氧化酶的结构具有很重要的作用。在本课题中，葡萄糖氧化酶与吖啶橙通过静电引力作用，溶剂中的离子强度对于葡萄糖氧化酶与吖啶橙之间的静电引力会造成一定的影响。我们考察了离子强度对GOx-CF与GOx/AO-CF两种不同吸附条件炭毡的影响情况，如图3.8与3.9所示。图3.8 GOx-CF工作电极的吸附液离子浓度比较图3.9 GOx/AO-CF工作电极的吸附液离子浓度比较如图3.8与3.9所示，无论是对于GOx-CF电极还是GOx/

44、AO-CF电极来说，吸附溶液中高离子浓度均降低葡萄糖氧化酶电极的电催化活性。虽然二次去离子水（离子浓度近似为零）具有最好的实验结果，但考虑到酶等生物活性组分在缓冲溶液中能够长期保持活性，因此我们仍然使用5mM作为下面实验的条件。3.9 GOx/AO-CF工作电极的重现性为了考察GOx/AO-CF电极的重现性，我们同时制作三个实验条件完全相同的电极，葡萄糖氧化酶的浓度为0.1mg/mL，吖啶橙的浓度为0.3mM，吸附溶液为5mM的BR缓冲溶液，pH为5。每支电极测定葡萄糖氧化酶为20mM时的催化电流，相对标准偏差为5%，说明该法制备的传感器重现性好。重现性实验结果如表3.6所示：表3.6 GOx

45、/AO-CF工作电极的重复性实验炭毡CF1CF2CF3平均值RSD%催化电流（A）121.78132.69137.53130.675.03.10 GOx/AO-CF工作电极操作稳定性考察在生物传感器中，电极的操作稳定性是一个很重要的指标，反应了电极连续工作的能力。电极的制备及测试条件同3.9。本课题同样对GOx/AO-CF电极的操作稳定性进行了考察。实验结果如图3.10所示，当对葡萄糖进行10次连续测试时，葡萄糖氧化酶电极的RSD%在4以下，这表明所制得的电极能够对底物进行连续测试。图3.10 GOx/AO-CF的操作稳定性数据（葡萄糖20mM）3.11 GOx/AO-CF工作电极储存稳定性考

46、察在实际应用中，工作电极的储存稳定性也是衡量生物传感器的一个很重要的指标。因此，本课题对于GOx/AO-CF工作电极进行了测试。电极的制备条件同3.9。每5天对GOx/AO-CF工作电极进行测试，测试完之后电极被保存在2mLBR缓冲溶液，并储存于4度的环境中。实验表明，在一个月的储存中，电极保持了初始活性的XXXX。由此可见，采用吖啶橙共同吸附法所制得的葡萄糖氧化酶电极能够长期保存活性，这对于葡萄糖氧化酶电极的应用与开发具有重要意义。结 论本课题使用有机染料吖啶橙(AO)与葡萄糖氧化酶（GOx）共吸附法将葡萄糖氧化酶固定于炭毡(CF)电极上（GOx/AO-CF），葡萄糖氧化酶与吖啶橙之间通过静

47、电引力作用结合，吖啶橙能够阻止酶在炭毡表面由于疏水作用等而导致部分失活，并且提高葡萄糖氧化酶的活性。实验中对吸附时间、葡萄糖氧化酶浓度、吖啶橙浓度、吸附液pH值、吸附液浓度、电解质溶液pH值等实验条件进行了优化。该方法具有简单，易于操作和酶活性保持良好等优点，在生物传感器及生物燃料电池电极的制备方面有现实的意义。本课题结论如下：（1）吸附液pH值为5时，葡萄糖氧化酶的吸附量达到了最大值。根据文献报道，葡萄糖氧化酶的等电点大约在4.2左右，是含有大量负电荷的酶。而吖啶橙是带有正电的有机染料。酶与吖啶橙之间通过静电引力作用结合，能够阻止酶在炭毡表面由于疏水作用而导致部分失活。（2）吸附时间为1小时

48、时我们得到了最好的结果，吸附时间过长不仅无法提高葡萄糖氧化酶的催化活性，而且还浪费工作时间。（3)电解质溶液pH值为5.5时葡萄糖氧化酶的工作最佳，因为在强酸、强碱的情况下都容易使葡萄糖氧化酶失活，而文献报道葡萄糖氧化酶最佳工作pH值为5.5左右，本实验结果与文献值符合。（4）葡萄糖氧化酶浓度为0.1mg/mL时氧化电流最大。在浓度低于0.1mg/mL时，由于葡萄糖氧化酶的吸附量少，因此所能反应的量也少，氧化电流小；在浓度高于0.1mg/mL时，由于炭毡表面的吸附量有限，使所有葡萄糖氧化酶不能完全展现其活性，因此再提高葡萄糖氧化酶的浓度，工作电流值反而是越来越低，同时还浪费了大量的葡萄糖氧化酶

49、。（5）吖啶橙浓度为0.3mM的时候，工作电极呈现出最高的活性。虽然吖啶橙浓度为0.4mM和0.5mM的时候也具有很高的活性，但考虑到实际成本，我们使用0.3mM作为优化条件。吖啶橙能够与带负电的葡萄糖氧化酶通过静电引力作用结合，结合后使葡萄糖氧化酶结构更加紧凑。（6）随着吸附溶液浓度升高，氧化电流逐渐降低。这是由于溶液中高的离子浓度阻碍葡萄糖氧化酶与吖啶橙之间的静电引力作用，因此高离子浓度不适合本研究的电极制备。但由于纯水会影响葡萄糖氧化酶的活性，而1mM的BR溶液的pH值范围相对较窄，因此我们使用5mM的BR溶液作为吸附溶液。（7）以相同条件同时制备三个GOx/AO-CF工作电极，以葡萄糖

50、为底物进行重现性的测试。结果表明，三个电极重现性的相对标准偏差为5%，说明该法制备的传感器重现性好，实验结果可信。（8）将GOx/AO-CF工作电极对20mM葡萄糖进行连续测试，经过10次连续测试表明，工作电极的相对标准偏差低于4%，说明本电极能够连续重复使用，具有很好的实际操作性能。（9）酶电极的储存稳定性对于生物传感器以及生物燃料电池的实际应用是一个很重要的指标，因此我们考察了GOx/AO-CF的储存稳定性，将电极测试后放于2mL BR缓冲溶液并置于4的环境中，经过一个月的测试（每5天测试一次），电极仍保持了初始活性的xxxx，实验表明本电极能够具备长期使用的能力，这为本电极将来的实际应用

51、打下了基础。 致谢本论文的完成是在我的导师王月老师的细心指导下进行的。在每次实验遇到问题时老师不辞辛苦的讲解才使得我的实验能够顺利的进行。从论文的选题到资料的搜集直至最后论文的修改的整个过程中，花费了王老师很多的宝贵时间和精力，在此向我的导师表示衷心地感谢！导师严谨的治学态度，开拓进取的精神和高度的责任心都将使我受益终生！同时感谢老师给我们提供的必要仪器、设备和实验室，感谢大学四年来所有的老师，为我们打下化工专业知识的基础。然后，还要感谢所有的同学们，是你们在我平时实验中和我一起探讨问题，使我能及时的发现问题把实验顺利的进行下去。本文参考了大量的文献资料，在此，向各学术界的前辈们致敬！最后感谢

52、化工学院和我的母校辽宁科技大学四年来对我的大力栽培。 参考文献1 张国梅，高春光，双少敏生物传感器的应用研究进展J中国生物工程杂志2004， 24（7）：65-692 Geyeva T A，Lavrik N V Rachkov A E，et a1An approach to conductometric immunosensor based on phthalocyanine thin filmJBiosensors and Bioelectronics， 1998，13(6)：359-3693 Vial J C，Garcia E，Castillo J RIn situ preparation

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