科学·技术·社会　植物的组织培养

1、 植物的组织培养实验目的：1.掌握植物组织培养基(MS)的配制(Murashige and Skoog)2.通过实验，掌握无菌操作方法，熟悉烟草愈伤组织的诱导及再生体系的建立的整个过程。3.学习再生体系的建立方法，为掌握其他植物的组织培养奠定基础；同时为转基因技术提供一个平台。植物组织培养基的配制烟草愈伤组织的诱导及再生体系的建立实验用品：1.仪器和用品：500 ml试剂瓶1个；100 ml试剂瓶5个； 250 ml试剂瓶4个；高压灭菌锅；电子天平；烧杯（大、中、小各2个）、玻璃棒、移液管、搪瓷缸、培养瓶、电炉、pH计或精密pH试纸、容量瓶（大、中、小各1个）2.化学药品及试剂 汉语名 分子式

2、 生产公司 分子量 纯度 硝酸铵 NH4NO3 上海通亚精细化工厂 80.04 分析纯 磷酸二氢钾 KH2PO4 中国江苏南京中山集团公司化工厂 136.09 硝酸钾 KNO3 上海鑫达精细化工有限公司 101.10 硫酸镁 MgSO4.7H2O 山东省化工研究院 246.47 氯化钙 CaCl2.2H2O (上海)四联化工厂 147.03 硫酸锰 MnSO4.4H2O 上海试剂工厂 169.02 硫酸锌 ZnSO4.7H2O 山东潍坊市试剂厂 287.54 硼酸 H3BO3 济南化学试剂厂 61.83 碘化钾 KI 上海化学采购站 166.064 钼酸钠 Na2MoO4.2H2O 北京五十六

3、0一化工厂 241.95 分析纯 氯化钙 CaCl2.6H2O 济南试剂总厂 237.93 五水硫酸铜 CuSO4.5H2O 济南化学试剂厂 249.68 汉语名 分子式 生产公司 分子量 纯度 乙二胺四乙酸钠 Na2-EDTA.2H2O 济南试剂总厂 372.24 分析纯 硫酸亚铁 FeSO4.7H2O 山东博山化学试剂厂 278.01 分析纯 甘氨酸 C2H5NO2 中国科学院上海生物化学研究所 75.07 分析纯 盐酸吡哆醇 C8H11O3N.HCl 中国医药上海化学试剂站 205.64 盐酸硫胺素 C12H17ClH4OS.HCl 中国新兴化工试剂研究所 337.27 烟酸 C6H5N

4、O2 北京芳草医药化工研制公司 123.11 化学纯 肌醇 C6H12O6 中国政翔化学试剂研究所 180.16 3-吲哚乙酸IAA（b-Indoleacetic acid） 天津天泰精细化工品有限公司 125.1 分析纯 萘乙酸 NAA C12H10O2 中国医药上海化学试剂公司 186.21 化学纯叶酸 C19H19O6N7 上海化学试剂厂 441.42 2,4-D （2,4-dichlorophenoxyacetic acid ）上海雪满生物科技有限公司 6-BA（N6-benzylaminopurine） 上海伯奥生物科技有限公司 225.25 蔗糖 sucrose 天津市广成化学试剂

5、有限公司 342.29 分析纯 琼脂 Agar 国药集团化学试剂有限公司 B.RMS培养基配制表母液化合物含量（终浓度）mg/L母液称量（mg） 配制量（ml）吸取量（ml/L）1号NH4NO3KNO3KH2PO4MgSO4.7H2O16501900170370165001900017003700500（扩大20倍）502号CaCl24404400同上503号ZnSO4.7H2OMnSO4.4H2OH3BO3NaMoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2OKI8.622.36.20.250.0250.0250.83430111531012.51.251.2541.5500（扩大1

6、00倍）104号Na2EDTAFeSO4 .7H2O37.327.8746556100（扩大200倍）55号VB1VB6甘氨酸烟酸（VB3）0.40.520.5202510025500（扩大100倍）106号肌醇1001000100107蔗糖330 g8琼脂0.61.28gMS母液配制用量g.L-1每升培养基取用量mL/L大量元素(20倍)KNO338NH4NO33350MgSO47H2O7.4KH2PO43.4CaCl2 H2O8.8微量元素(200倍)MnSO4 4H2O4.465ZnSO47H2O1.72H3BO31.24KI0.166NaMoO42 H2O0.05CuSO45H2O0.

7、005CoCl6H2O0.005铁盐Na2-EDTA2 H2O7.465FeSO47H2O5.56有机附加物(200倍)甘氨酸(氨基乙酸)0.25VB60.05VB10.01烟酸0.05肌醇0.01生长素类在组培中的作用：诱导细胞的分裂和根的分化。常用种类及作用：IAA(吲哚乙酸)、 NAA、 IBA、NOA（萘氧乙酸）、 2.4D、 2.4.5T（三氯苯氧乙酸）使用时先配成母液，母液的浓度一般为0.1 mg/ml或1 mg/ml；配时一般先将其粉末溶于95乙醇或0.1 mol/L的NaOH中，再定容。细胞分裂素类在组培中的作用：促进细胞分裂和由callus或器官上分化不定芽。常用种类及作用：

8、BAP（苄氨基嘌呤）、6BA（苄基腺嘌呤），zip（异戊烯氨 基嘌呤）和KN（激动素）使用时先配成母液，母液的浓度一般为0.1 mg/ml或1 mg/ml；配时一般溶于0.5或1 mol/L的HCl或稀薄的NaOH中，再定容。实验步骤：1.母液的配制： 见MS培养基配制表2.培养基的配制：1）称取一定量的蔗糖，溶解于适量蒸馏水中（不能太多），倒入500ml容量瓶中。2）吸取各种母液（吸取量根据培养基的最终体积决定），加入到上述容量瓶中。3）吸取各种激素（所配制的培养基是：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L ），加入到上述容量瓶中。4) 定容到500 ml。5）将上述溶液调p

9、H值到5.8-6.0。6) 将上述溶液加入琼脂后，于电炉上煮沸。7）将上述培养基冷却至40-50 摄氏度后，将其分装到100 ml三角瓶中。8）将三角瓶用封口膜封口。并对不同的培养基做好标记。3.灭菌： 通常培养基应在汽相121摄氏度的条件下在高压灭菌锅内灭菌20 min。 在高压灭菌锅的加热过程中，在气压指针上升到0.05 Mpa时，放一次气，然后在温度达121摄氏度时，保持此压力灭菌15-20 min。灭菌完成后，待灭菌锅的压力降到0时，打开灭菌锅，取出培养基，放平，待培养基凝固后备用。注意事项：1.实验中所用的各种容器一定要洗净、烘干。2.用电子天平称量药品时，一定要用称量纸，对于有腐蚀

10、性的药品，应将其放在小烧杯中称量。3.各种母液应保存在2-4摄氏度的冰箱中，以免变质、长霉。4.用高压灭菌锅时，一定要先检查一下其中的水是否合适。接种： 在无菌的条件下，取烟草无菌苗的叶片，剪成（0.51cm）*(0.51cm)大小的小块，接种于诱导培养基MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L中诱导愈伤组织，在此培养基上能诱导出愈伤组织并能够诱导出不定芽。不定芽生根： 将在愈伤组织中生成的不定芽移栽到1/2 MS培养基中，其目的是诱导不定芽生根，使其发育成烟草小植株。 植物材料灭菌的常用药品和原理1.乙醇：原理：脱水作用和溶脂性，从而使Protein脱水、变性、沉淀及质膜破损、

11、透性增加，使微生物致死。使用浓度：70（V/V）灭菌时间：560 s2.次氯酸盐：原理：在水中形成次亚氯酸（HClO），HClO分解后形成盐酸和新生态氧（ HClOHCl+O-）， O-具有很强的 氧化性而具有杀菌作用。使用浓度：0.52.5的有效氯灭菌时间：515 min3.升汞（HgCl2）：原理：汞离子可与带负电荷的蛋白质结合，使菌体蛋白变性，酶失活。其杀菌效力极强。 使用浓度：0.1-0.2（W/V）灭菌时间：10 min4.新洁尔灭：原理：广谱表面活性灭菌剂。 使用浓度：1：200（V/V）灭菌时间：30 min或更长 接种第一天 接种第二天，因为外植体细胞开始被诱导脱分化，并不断分

12、裂增殖，造成叶片中央与边缘的细胞分裂不均匀，因此，叶片中央凸起。接种第五天，脱分化细胞不断分裂增殖，形成愈伤组织，表现为叶片边缘泛黄增厚，叶片中央进一步凸起。接种第九天，脱分化细胞不断增值，愈伤组织不断增厚，整个叶片都翘起，并且已经开始再分化形成绿色生长点。第九天（诱导生成愈伤组织） 接种第十九天，绿色生长点进一步发育形成了不定芽，不定芽长度最长可达1 cm 。 第十九天（长出幼叶） 将不定芽在无菌条件下，从芽的基部切下，然后插入生根培养基中（1/2 MS），诱导生根。 芽的生根情况qq红包群 qq红包群 vhd60wkw 原本这种煮饭端茶的粗活是要归黄大哈咯负责的，可一来是夜叉不喜欢黄大哈咯

13、做的饭茶，二来呢，今天这黄大哈咯吧，不错眼珠的看着公孙公子，脚更是挪不开地儿了。何况，陆婉娉今天也没打算支使黄大哈咯做饭，她此时可是巴不得与这位公孙大爷拉开一定的距离的，“黄哈咯，你陪公孙公子喝茶聊天，本大人今天就亲自下厨了。”“唉，知道了，女鬼大人。”黄如月心里是一千遍一万遍的感激加激动，女鬼大人真是俺肚肚里的蛔虫啊，知己啊！“夜叉，过来给姑姑择菜杀鸡。”拿过公孙公子手中乱七八糟的东西，一面往厨房走，女鬼大人一面招呼着不知道猫在哪里得瑟的夜叉。不知道是对陆婉娉的声音敏感还是对那只陆婉娉口中的鸡感觉兴趣，总之，话音刚落，夜叉就从里院蹦了出来，“姑姑，今天吃鸡啊！”夜叉一边搓着手，一边嘻嘻笑着跑

14、了过来，孩子般的嚷嚷着，“就知道公孙公子来了会有好吃的，鸡啊鸡啊我爱你，就象老鼠爱大米，咔嚓咔嚓咬死你！”接过陆婉娉手中的鸡，夜叉一只手掐鸡头，一只手掐鸡身子，咔嚓这么一拧，这只鸡就身首各异了，再看夜叉也不含糊，张开嘴直接朝向鸡脖子咕咚咕咚的开始喝起了鸡血。“这样杀鸡的方式倒也别致，我也会。”一起跟进来的公孙公子也不甘示弱，顺手拎起另一只鸡，把脖子一拧，血还没喷出来之前，直接塞到夜叉嘴里，那夜叉刚吸完一只鸡的血，转头就看到了公孙公子的杰作，这下她可不干的，哇的一声哭了起来，“你，你赔，这是给小爱的鸡！”小爱，小爱又是谁？难不成这女鬼中介还有传说中的吸血鬼了？要知道，某些传说中的东西在这个古朴的近乎于纯洁的太平镇，那可以说是只有你想不到的，没有太平镇所没有的事物啊！吸血鬼在太平镇根本就不可能是传说方才夜叉这杀/鸡的一幕已经够雷人了，又出来一个莫名其妙的小爱，先前做过调查了，没听说这女鬼中介还有其他的人啊！陆婉娉无奈的摇了摇头，“小爱是只小狼，是夜叉的宠/物。”哦哦哦，终于明白了，这一家人可真够奇怪的，不仅一个人取的名字雷人，就连这养的宠/物也是与众不同，人家是养温驯的阿猫阿狗的，她们这