大肠菌群的检验.课件

1、实验八大肠菌群的检验第1页，共28页。实验目的掌握鉴别大肠菌群的方法。掌握以最大概率数法测定大肠菌群数量的方法。第2页，共28页。实验原理 大肠菌群指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品有否被肠道致病菌污染。 食品中大肠菌群以100ml 检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。第3页，共28页。第4页，共28页。实验设备恒温培养箱：（361）显微镜培养皿 试管、移液管、三角烧瓶、小倒管天平载玻片第5页，共28页。实验试剂乳糖胆盐发酵管： 20g蛋白胨、5g 猪胆盐及10g乳糖溶于1L水中，校正p

2、H为7 .4，加25ml溴甲酚紫指示液(0.4 g/L)，分装每管20 ml, 并放入一个小倒管，115高压灭菌20 min。伊红美蓝琼脂平板： 10g蛋白胨、2gK2HPO4及17g琼脂溶解于1L水中，校正pH至7.1，分装于锥形瓶内，121高压灭菌15min。临用时加人10g乳糖并加热溶化琼脂，冷至5055。加人20mL伊红溶液（20g/L)和10ML美蓝溶液（6.5g/L）摇匀，倾注平板。第6页，共28页。乳糖发酵管： 将20 g蛋白胨和10g乳糖溶于1L水中，校正pH至7.4，加入25mL溴甲酚紫指示液(0.4g/L)，按检验要求分装，并放人一个小倒管，加热至115高压灭菌15 min

3、灭菌生理盐水：0.9第7页，共28页。革兰氏染色液： 结晶紫染色液： 1g结晶紫溶于20mL95%乙醇，与80mL草酸铵溶液（10g/ L)混合，摇匀。 革兰氏碘液： 1g碘与2g碘化钾混合后，用少量水溶解，稀释至300 mL。 沙黄复染液： 0.25g沙黄溶于10ml95%乙醇中，然后用90ml水稀释，混匀。第8页，共28页。实验内容与步骤1）检样稀释（无菌操作）将25mL（或g）检样置于含225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶，充分振摇（固体检样用匀浆器，用800010000r/min的速度处理1 min）制成1：10的均匀稀释液。用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生

4、理盐水的试管内，混匀，制成1 ：100的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按操作依次做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1 mL灭菌吸管。第9页，共28页。 2）乳糖发酵实验 接种2mL待检样品于乳糖胆盐发酵管内。接种3个稀释度，每一稀释度接种3管，置（36土1)温箱内培养（24士2) h。如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠杆菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。第10页，共28页。3）分离培养 将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝琼脂平板上，置（36士1)恒温箱内培养18一24 h。取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。第11页，共28页。4）证实试验 在上述平板上，挑取可疑大

5、肠菌群菌落1一2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（36士1)恒温箱内培养（24士2) h，观察产气情况。凡乳糖产酸产气、革兰氏染色为阴性的无芽袍杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。第12页，共28页。实验报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（或g）大肠菌群的MPN。第13页，共28页。第14页，共28页。第15页，共28页。第16页，共28页。第17页，共28页。注：本表采用3个稀释度：1ML(g)，0.1mL(g）和0.01 mL (g)。每稀释度3管。 表内所列检样量如改用10mL(g)，1mL(g）和0.1mL(g）时，表内数字应相应降低10倍；如改用0

6、.1ML(g), 0.01ML(g）和0.001mL(g）时，则表内数字应相应增加10倍，其余可类推。第18页，共28页。1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法附1：平板划线接种方法第19页，共28页。第20页，共28页。第21页，共28页。第22页，共28页。附2：革兰氏染色法操作步骤1、涂片：取大肠杆菌制成涂片，干燥，固定。2、染色：用草酸铵结晶紫染色1min ,用水冲洗。3、媒染：滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖1min，用水冲去碘液。4、乙醇脱色：斜置载玻片于一烧杯上，滴加95%乙醇，并轻轻摇动载片，至乙醇液不呈现紫色时停止（约0.5min）。立即用水冲净乙醇并

7、用滤纸轻轻吸干。脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时阴性菌被误染为阳性菌。第23页，共28页。5、复染：蕃红染液复染1min ,水洗。6、吸干并镜检：若研究工作中要确证未知菌的革兰氏反应时，则需同时用已知菌进行染色作对照。第24页，共28页。步骤：结果: 阳性菌紫色 阴性菌红色结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色蕃红复染涂片固定革兰氏染色法（Gram Stain）第25页，共28页。 细菌经结晶紫初染染成紫色。 革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为紫色。 革兰氏染色阴性菌（G-）细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经蕃红复染成红色。第26页，共