克隆基因的表达和常见系统的类型

1、克隆基因的表达和常见系统的类型克隆基因的表达和常见系统的类型克隆基因的表达：指的是外源基因在宿主细胞中表达。外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中 表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞。克隆基因的表达和常见系统的类型克隆基因的表达和常见系统的类型一、 常见表达系统的类型原核生物基因表达系统真核生物基因表达系统大肠杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统链霉菌表达系统酵母表达系统丝状真菌表达系统昆虫表达系统哺乳动物细胞表达系统植物生物反应器克隆基因的表达和常见系统的类型二、表达体系的组成： 表达载体 受体细胞克隆基因的表达和常见系统的类型表达载体的构成启动子终止子核糖体结合位点（SD序

2、列）筛选标记复制子（质粒拷贝数）多克隆位点启动子操纵子S-D序列目的基因终止子克隆基因的表达和常见系统的类型1、启动子 启动子是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，位于基因的上游，长度因生物种类而异，具有如下特征：序列特异性：具有保守序列筐位置特性：位于基因的上游或基因内的前端方向性种属特异性克隆基因的表达和常见系统的类型如常见的启动子：启动子-10区序列-35区序列TTGACAGATACTTTGATATATAATTAGACATAATGTTTGACATTAACTTTTACATATAATTTGACATATAATP LPrecAPtraAPtrpPlacPtac-35区序列克隆基因的表达和

3、常见系统的类型启动子从转录模式上分为：组成型启动子和诱导型启动子表达系统启动子必须具备的条件： 必须是一种强启动子 能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。 应呈现低水平的基础转录便于表达毒性蛋白等。应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。克隆基因的表达和常见系统的类型 表达系统常选用 启动子注意了！诱导型避免前期表达目的产物对菌株生长的影响；减少细菌蛋白酶对目标基因产物的降解。诱导型工作的典型例子： 乳糖操纵子模式原因？克隆基因的表达和常见系统的类型用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。乳糖操纵子：乳糖启动子lac，来自大肠杆菌克隆基因的表达和常见系统的

4、类型乳糖启动子Plac的可控性：加入乳糖类似物：异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导作用克隆基因的表达和常见系统的类型色氨酸启动子Ptrp的可控性克隆基因的表达和常见系统的类型2、终止子作用：防止转录过头。 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，外源基因本身的转录效率下降； 增加工程菌无谓的能量消耗； 影响重组质粒的不稳定性； 过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低基因编码产物的翻译效率启动子操纵子S-D序列目的基因终止子克隆基因的表达和常见系统的类型3、核糖体结合位点（ RBS） （ribosome binding site） 即位于

5、翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5 UAAGGAGG 3，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3端区域3 AUUCCUCC 5并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译。tac lac OS-D/ATGGST插入位点TGAlacP也叫SD序列 ：Shine-Dalgarno sequence是mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列克隆基因的表达和常见系统的类型（1）SD序列与起始密码子之间的序列对表 达的影响：、SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；、碱基若为CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。、紧邻AUG的前三个

6、碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20。克隆基因的表达和常见系统的类型SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约7个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。（2）SD序列与起始密码子之间的距离的影响：克隆基因的表达和常见系统的类型三、大肠杆菌表达系统 全基因组测序，共有4405个开放型阅读

7、框架； 基因克隆表达系统成熟、完善； 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定； 被FDA批准为安全的基因工程受体生物。1、大肠杆菌表达外源基因的优势：克隆基因的表达和常见系统的类型 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能； 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统； 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白； 周质内含有种类繁多的内毒素。2、大肠杆菌表达外源基因的劣势：克隆基因的表达和常见系统的类型3、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位1）. 细胞质中表达 表达蛋白常以包涵体（inclusion body）形式存在。包涵体是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。形成原理未知。克隆基因的表达和

8、常见系统的类型2）. 在周质（periplasm）中表达 周质：格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。 蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚。优点：容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。在这啊！克隆基因的表达和常见系统的类型 由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。 通常用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白，或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。 使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。3）. 胞外表达3、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位克隆基因的表

9、达和常见系统的类型4、外源基因在大肠杆菌中的表达形态表达蛋白按溶解特性通常包括：不溶性蛋白和可溶性蛋白两类，具体包括如下几种结构形态：包涵体型蛋白融合型蛋白分泌型蛋白克隆基因的表达和常见系统的类型1）包涵体型蛋白： 蛋白聚集成致密无膜的裸露结构，存于细胞质或细胞周质中，无正确的空间构象，一般无生物活性。 、包涵体表达形式的优点：外源基因表达产物易于分离纯化；能在一定程度上保持表达产物的结构稳定；能表达对宿主有毒或有致死效应的目标蛋白。在这啊！克隆基因的表达和常见系统的类型、包涵体型蛋白表达形式的缺点：、包涵体用变性溶剂溶解、复性后， 不 一定能恢复生物学活性，回收的蛋白 生物活性差 ；、复性成

10、本较高。克隆基因的表达和常见系统的类型2）、分泌型异源蛋白的表达 分泌异源蛋白通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。 蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件。克隆基因的表达和常见系统的类型phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-内酰胺酶（lactamase）、 肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等 常用的原核信号肽：如大肠杆菌信号肽：能带领蛋白穿过膜到达周质，但以后需要正确切割掉。信号肽（signal peptide）：一般位于N端。克隆基因的表达和常见系统的类型目的蛋白稳定性高目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整外源真核生物基因很难

11、在大肠杆菌中进行分泌型表达；表达率通常要比包涵体方式低。 、分泌表达形式的优点： 、分泌表达形式的缺点：克隆基因的表达和常见系统的类型3）融合型蛋白 将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起进行表达，并能正确折叠形成良好的杂合构象，但不同于天然构象。目的蛋白稳定性高；目的蛋白易于分离；目的蛋白表达率高；目的蛋白溶解性好；目的蛋白需要回收；特点：GST/His目的基因克隆基因的表达和常见系统的类型例子： pTYB11，pTYB12: intein在N端克隆基因的表达和常见系统的类型利用Intein 分离纯化外源蛋白Intein与Chitin柱结合DTT或-巯基乙醇或半胱氨酸能够诱导Intei

12、n的自我裂解活性克隆基因的表达和常见系统的类型 载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。S-D序列ATG-外源基因-TAG优点：5、几种类型的原核表达载体1）. 非融合型表达载体 产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。克隆基因的表达和常见系统的类型克隆基因的表达和常见系统的类型 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。如：pIN III系列： 2）. 分泌型表达载体pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,分泌信号肽外膜蛋白基因Ipplac Plac OS-

13、D/ATGompa插入位点克隆基因的表达和常见系统的类型 表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。3）. 融合蛋白表达载体：如pGEX系列优点：便于融合蛋白的分离和纯化。lacItac lac OS-D/ATGGST插入位点TGAlacPGST：谷胱甘肽巯基转移酶克隆基因的表达和常见系统的类型柱（column）GST外源蛋白凝血酶 外源蛋白柱（column）GSTGST洗脱柱（column）可再利用GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化。分离和纯化：克隆基因的表达和常见系统的类型其它融合蛋白系统：His-tag（组氨酸标签）：在外源多

14、肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。克隆基因的表达和常见系统的类型5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -35box -10box（Pribnow Box）6、影响外源基因表达效率的因素1）. 启动子的结构对表达效率的影响RNA聚合酶 亚基的识别位点（1）一致顺序克隆基因的表达和常见系统的类型（2）-35区与-10区之间的距离间隔为17bp时，启动子最强。（3） -35区和-10区的碱基顺序越接近一致顺序，启动子越强。5-TTGACA TATAAT 一致顺序lactrpPL recAtac I

15、tac II5-TTTACA TATGTT 5-TTGACA TTAACT 5-TTGACA GATACT 5-TTGATA TATAAT 5-TTGACA TATAAT 5-TTGACA TTTAAT -35box-10box克隆基因的表达和常见系统的类型S-D序列后面的4个碱基：如果是A（T）, 翻译效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。2）. 转译起始序列对表达效率的影响（1）S-D序列5-AGGAGGU-3 ？AUG左侧的三个碱基有影响。 （2）起始密码AUG3）. 启动子与外源基因之间的距离克隆基因的表达和常见系统的类型 转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪

16、费源量和能量、不会干扰正常的表达。 增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目，增加表达效率。4）. 转录终止区对表达效率的影响5）.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响6）.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响 但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。克隆基因的表达和常见系统的类型1）、表达载体的优化设计；2）、提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性；3）、密码子偏爱性；4）、表达环境条件的优化。7、提高外源基因表达常用的方法与途径克隆基因的表达和常见系统的类型1）、表达质粒的优化设计启动子：选择诱导型强启动子 如进行基因的诱导表达，将宿主生长代谢与外源基因表达分开。SD序列：UA

17、AGGAGG高于3倍AAGGA；调整SD序列和起始密码AUG间碱基长度：一般为5-9bp 为宜；SD序列和起始密码AUG间碱基序列：A/T丰富则翻译效率高。克隆基因的表达和常见系统的类型2）、提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性：目标基因mRNA的序列和结构改造：5加“发夹”结构；3加稳定序列；采用缺乏某种蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌；改造基因碱基序列包涵体形式、融合型表达目的基因。克隆基因的表达和常见系统的类型3）、密码子偏爱性：基因突变改变稀有密码子共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因4）、表达环境条件的优化。培养基温度克隆基因的表达和常见系统的类型8、据蛋白用途选择基因的表达策

18、略1）、表达蛋白用于生物化学和分子生物学研究 主要考虑保持蛋白质原有的功能不变表达策略： 融合表达 直接表达克隆基因的表达和常见系统的类型2）、表达蛋白用作抗原 主要考虑表达蛋白的快速提纯表达策略： 以包涵体形式合成目的蛋白 融合表达目标蛋白（不用去除标签蛋白）克隆基因的表达和常见系统的类型3）、表达蛋白用作结构研究 表达蛋白以天然可溶形式产生表达时考虑因素： 表达温度（高温促进包涵体的形成） 表达水平（高表达促成包涵体的形成） 表达载体受体菌克隆基因的表达和常见系统的类型9、原核表达系统的注意事项1）.外源基因不能带有内含子。2）. 必须用cDNA3）. 不能直接用真核基因组DNA。4）. 须利用原核细胞的调控原件（启动子等）5）. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。克隆基因的表达和常见系统的类型四、酵母表达系统大肠杆菌表达系统的缺陷 缺少翻译后的修饰和加工 表达蛋白多以包含体形式存在酵母（酿酒酵母）表达系统 繁殖快，能高密度发酵 可对表达蛋白进行翻译后的修饰和加工克隆基因的表达和常见系统的类型甲醇酵母表达系统甲醇酵母的生物学特点：能利用甲醇为唯一碳源，主要受乙醇氧化酶调控（AOX1，AOX2），其它碳源：葡萄糖和甘油；生长温度：2830 ，超过32不利于表达克隆基因的表达和常见系统的类型表达载体和受体菌受体菌：组