微生物学课件：3 细菌的生化反应

1、细菌的生化反应所谓细菌的生化反应，是指利用生物化学的原理，来测定细菌对各种物质的代谢能力、代谢途径、代谢方式以及代谢产物的不同，从而对细菌进行鉴别鉴定的方法。细菌的生化反应类型很多，但若按其基本原理来区分，则主要包括“糖（醇）类代谢试验”、“蛋白质和氨基酸的代谢试验”、“有机酸盐和铵盐的利用试验”、“呼吸酶及其它酶类检测试验”这四个基本内容。第一节 糖（醇）类代谢试验所谓糖醇类代谢试验是指测定细菌对各种糖（醇）和糖苷的代谢能力、代谢途径、代谢方式、代谢产物，从而对细菌进行鉴定的一类试验。糖的种类很多，有单糖、双糖、多糖；醇和糖苷的种类也很多，但临床上常用的有：单糖：葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、

2、甘露糖、果糖、木糖及半乳糖；双糖：蔗糖、乳糖、蕈糖、麦芽糖；多糖：肝糖、菊糖、糊精、淀粉等。醇类主要有：山梨醇、侧金盏花醇、 甘露醇、卫矛醇、肌醇、肝油等。糖苷类主要有：水杨苷、七叶苷等一、 糖醇类发酵试验 1、原理：将细菌接种到含有单一的某种可分解糖（醇、糖苷）的液体、半固体或固体培养基中，由于不同的细菌含有发酵不同糖（醇、糖苷）的酶，所以分解糖（醇、糖苷）的能力有所不同。若细菌能分解某种糖（醇、糖苷），则可产生大量的酸性物质，使培养基的ph值下降，使酸碱指示剂呈现酸色。细菌分解糖醇类产酸后，有的细菌还能将酸性物质继续分解，产生气体，有的不能继续分解酸性物质，不能产生气体。由于不同细菌分解糖

3、（醇、糖苷）的能力不同，分解后的代谢产物也不同，故此类试验可作为鉴别细菌的重要依据。 2、培养基：糖（醇、糖苷）类发酵培养基，含糖（醇、糖苷）浓度一般为510g/L（0.51%），并在培养基中加入酸碱指示剂。最常用的培养基是液体培养基，即在肉膏汤中加入510g/L的某一糖（醇、糖苷）和1.6%的溴甲酚紫指示剂，（同时在培养基中倒置一德拉姆氏管（Durham），高压灭菌后备用。由于培养基正常的pH值为7.27.4,故此时培养基指示剂显碱色（淡紫色）。3、方法：将被检菌接种入糖（醇、糖苷）类发酵培养基中，37培养1824小时，观察结果。4、结果观察：、培养基颜色不变（仍为淡紫色）， 则为阴性；用“

4、”表示。、培养基变黄，导管中无气泡，为阳性，但产酸不产气；用“+”表示。、培养基变黄，导管中有气泡，为阳性且产酸产气；用“”表示。二、糖（醇、苷）类代谢类型试验这一类试验中，最典型的代表就是葡萄糖氧化/发酵试验（O/F）1、原理：细菌利用糖的方式有氧化和发酵两种类型。其中在分解过程中必须由氧分子参加的为氧化型；能进行无氧酵解的为发酵型，发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖。 不同细菌分解葡萄糖的能力不同，能分解葡萄糖的不同细菌，其分解方式也有所不同。O/F试验就是利用两管同样的含唯一一种可分解糖葡萄糖的培养基，一管处于有氧状态；另一管造成厌氧环境，接种细菌并经培养后，分别观察细菌在有

5、氧和无氧环境中分解葡萄糖的能力，从而确定细菌对糖的分解类型的一类试验。2、培养基：通常所用的培养基是两管含葡萄糖的半固体琼脂，其中一管加有1ml的液体石蜡（隔绝空气），称“F管”；另一管不加石蜡，称“O管”）。培养基中含有溴麝香草酚兰（BTB Brom Thymol Blue）指示基。BTB在不同pH下的颜色变化为：酸性中性碱性 黄色 绿色 蓝色由于培养基在正常状态下呈中性，故正常状态呈绿色。3、方法：用接种针挑取被检菌，以穿刺接种法分别接种入“O”管和“F”管中，37培养1824小时，观察结果：4、结果观察： 5、意义：（1）、用于葡萄球菌属与微球菌属的 鉴别：（2）、用于肠杆菌科、弧菌科与

6、非发酵菌的鉴别。6、质控菌株： “O”型：铜绿假单胞菌； “F”型：大肠埃希氏菌。三、葡萄糖代谢产物的测定这一类试验的典型代表是“甲基红试验”（MR， Methylene Red）1、原理：不同的细菌分解葡萄糖后的代谢产物是不同的，如大肠埃希氏菌分解葡萄糖后产生丙酮酸，丙酮酸再进一步分解为甲、乙、丙、丁酸、乳酸、琥珀酸等各种酸类物质，而使培养基的ph值下降，当pH值下降至pH4.5以下时，加入甲基红指示剂，培养基呈现红色，此为阳性反应。 若细菌分解糖后产酸量较少，或产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、酮、醛、气体或水）培养基的pH值则保持在5.4以上，此时加入MR指示基，培养基呈桔黄色，此为阴

7、性反应。因此，利用MR试验可测定细菌分解糖类后的代谢产物是酸类还是其它物质，从而用于细菌的鉴别。 2、培养基和试剂： 葡萄糖磷酸盐蛋白胨水 MR指示剂3、方法：将被检菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，37培养1824小时，加入MR指示剂23滴，立即观察结果。4、结果观察：培养基呈红色者为阳性； 桔黄色为阴性。5、意义：主要用于肠杆菌科各属、种间的鉴别。6、质控菌：阳性菌株：大肠埃希氏菌； 阴性菌株：产气肠杆菌。四、葡萄糖分解途径的测定(VP二氏试验)1、原理：2、方法：、奥梅拉氏法（OMeara）：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，经37孵育48小时后，按1ml培养基加0.1ml 40%KOH（含

8、0.3%肌酸或肌苷）溶液，置4850水浴中2小时或37孵箱4小时，充分摇动，观察结果。结果：出现红色者为阳性。、贝立脱氏法（Barritt）试剂：甲液：6%奈酚酒精溶液； 乙液：40%KOH溶液。方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，经37，1824小时孵育后，按每毫升培养液加甲液1ml，乙液0.4ml，充分振摇，观察结果。结果：如立即或于数分钟内出现红色者为阳性；若为阴性，应将试管置37，4h后再行观察。（注：Barritt氏法比OMeara氏法敏感，故临床较常用。）3、意义：主要用于肠杆菌科各属、种间的鉴别。4、质控菌：阳性菌株：产气肠杆菌； 阴性菌株：大肠埃希氏菌。五、乳糖分解能力测定-

9、半乳糖苷酶试验（ONPG）1、原理：细菌分解乳糖需要两种酶。半乳糖苷渗透酶：转运乳糖。-半乳糖苷酶：分解乳糖。有的细菌可产生-半乳糖苷酶，能分解邻硝基酚- -D-半乳糖苷（ONPG）, 从而生成黄色的邻硝基酚。2、试剂：0.75M ONPG溶液：取ONPG 80mg溶于15ml蒸馏水中，再加入缓冲液5ml(6.9gNaH2PO4溶于45ml蒸馏水中，用30%NaOH调整pH为7.0,再加水至50ml)。置4 冰箱保存。ONPG溶液本身无色，如出现黄色则不宜再用。3、方法：取被检菌1824h菌落，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇。将试管置37 水浴5分钟，加入0.2

10、5mlONPG试剂，水浴20分钟3小时，观察结果。4、结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应（一般在2030min内显色）。5、意义：本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。6、质控菌：阳性：大肠埃希氏菌 阴性：普通变形杆菌第二节 蛋白质和氨基酸的代谢试验蛋白质和氨基酸是细菌有机氮的来源，由于蛋白质分子大，不能被细菌直接吸收利用，须先经过胞外蛋白酶把蛋白质分解成可以透过细菌细胞壁和细胞膜的多肽和氨基酸，即由于不同细菌对不同的蛋白质和氨基酸的分解能力、代谢方式和代谢产物各不相同，故此类试验可作为鉴别细菌的重要指标。一、靛基质试验（Indol Test）1、原理：本试验主要是测定细菌能否产生色氨酸酶的一

11、种试验。有的细菌如大肠埃希氏菌能产生色氨酸酶，因而能分解培养基中的色氨酸产生吲哚（靛基质），后者与试剂中的对位二甲氨基苯甲醛作用生成玫瑰靛基质而显红色。2、培养基和试剂：培养基：蛋白胨水试剂：Ehrlich试剂： 对二甲氨基苯甲醛 1g， 无水乙醇 95ml, 浓盐酸 20ml3、方法：将待检菌接种于蛋白胨水中，3537培养1824h，沿试管壁轻轻加入Ehrlich试剂约0.5ml，使两液之间形成一交界面，于交界面出现红色者为阳性。4、意义：主要用于肠杆菌科内各属、种的鉴别。5、质控菌：阳性菌株：大肠埃希氏菌；阴性菌株：产气肠杆菌。二、H2S试验1、原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如

12、胱氨酸、半胱氨酸）产生硫化氢，硫化氢遇铅或亚铁离子，可形成黑色的硫化铅和硫化亚铁沉淀。2、培养基：醋酸铅培养基。3、方法：将被检菌穿刺接种于醋酸铅培养基中， 3537培养1824h，观察结果。4、结果：培养基变黑为阳性，不变色为阴性。5、意义：主要用于肠杆菌科的属种鉴定。6、质控菌：阳性：普通变形杆菌 阴性：大肠埃希氏菌三、尿素分解试验1、原理：有些细菌能产生尿素酶，能将培养基中的尿素分解产生大量的胺，从而使培养基变碱并使酚红指示剂变红。2、培养基：尿素培养基。3、方法：将被检菌接种于尿素培养基，3537培养1824h，观察结果。4、结果：培养基变红为阳性，不变色为阴性5、意义：主要用于肠杆菌

13、科的属种间鉴别。6、质控菌：阳性：普通变形杆菌 阴性：大肠埃希氏菌四、苯丙氨酸脱氨酶试验1、原理：有些细菌如变形杆菌属可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基后生成苯丙酮酸，后者与三氯化铁试剂作用，可形成一种不稳定的绿色化合物。从而使苯丙氨酸斜面变为绿色。2、培养基与试剂： 培养基：苯丙氨酸琼脂斜面； 试剂：10%FeCL3溶液。3、方法：将试验菌大量接种于苯丙氨酸斜面上，37孵育1824小时；沿斜面滴加10%FeCL3试剂45滴，使其沿斜面上方流下，立即观察结果，斜面出现绿色者为阳性。4、注意事项：结果必须立即观察，若延长时间，则绿色会消退。5、用途：主要用于肠杆菌科的初步分群。6、质控菌：

14、阳性菌株：普通变形杆菌；阴性菌株：大肠埃希氏菌。五、氨基酸脱羧酶试验1、原理：本试验是测定细菌能否产生氨基酸脱羧酶以及氨基酸脱羧酶种类的一种试验。临床上常用的氨基酸脱羧酶试验共有三种：即赖氨酸脱羧酶试验、鸟氨酸脱羧酶试验和精氨酸脱羧酶试验。各种细菌产生氨基酸脱羧酶的种类虽不尽相同，但氨基酸发生脱羧基反应后的产物却是基本相同的，即都产生胺和CO2。如：由于胺是碱性物质，大量胺的产生使培养基的Ph值升高（7.0以上），从而使培养基中的溴甲酚紫指示剂显紫色。2、培养基：试验管：含0.1%葡萄糖；0.5%相应氨基酸；溴甲酚紫指示剂。对照管：除不含相应的氨基酸外，余均同试验管。 两管均应加入液体石蜡或矿

15、物油，以隔绝空气。3、方法：将试验菌分别接种于氨基酸脱羧酶培养基和对照培养基中，3537培养14天（此时细菌首先分解葡萄糖产酸，使培养基变黄；再使氨基酸脱羧产生胺，由于培养基中氨基酸的含量是葡萄糖含量的五倍，故产碱量远远大于产酸量，因此阳性者最终指示剂显碱色），观察结果。4、结果观察：5、意义：主要用于肠杆菌科的属、种鉴定。6、质控菌株： 第三节 有机酸盐和胺盐利用试验一、枸橼酸盐利用试验（Citrate Test）1、原理：本试验就是测定细菌能否利用枸橼酸盐作为唯一的碳源和能否利用磷酸二氢铵做为唯一氮源的一种试验。当把细菌接种到只含有枸橼酸盐和磷酸二氢铵这种唯一碳源和氮源的培养基中时，若细菌

16、不能利用这种唯一的碳源和氮源，则细菌不能生长；若细菌能以此作为唯一的碳、氮源，则能利用其生长繁殖，并将枸橼酸盐转变为碳酸盐，同时将磷酸二氢铵分解成磷酸盐和NH3。由于碳酸盐和NH3均属碱性，故大量产生后可使培养基变碱，使溴麝香草酚兰指示剂变蓝色。 2、培养基：西蒙氏枸橼酸盐斜面培养基3、方法和结果：将被检菌大量接种于西蒙氏枸橼酸盐培养基斜面上，3537培养1824小时后观察结果，若培养基斜面由绿色变为蓝色，则为阳性；若培养基斜面仍为绿色为阴性。 4、质控菌株：阳性：产气肠杆菌； 阴性：大肠埃希氏菌。5、意义：主要用于肠杆菌科的属、种鉴别。二、葡萄糖酸盐利用试验1、原理：该试验是测定细菌在生长繁

17、殖过程中能否利用葡萄糖酸盐作为唯一碳源的一种试验。有些细菌如产气肠杆菌，能利用葡萄糖酸盐作为唯一碳源，因此能将葡盐分解，生成酮基葡萄糖酸，后者具有较强的还原性，在高温环境中，可将兰色的班氏硫酸铜（或可溶性氢氧化铜）中的二价铜离子还原成棕红色不溶性的氧化亚铜沉淀。2、培养基和试剂：培养基：葡萄糖酸盐蛋白胨肉汤 蛋白胨 1.5g 酵母浸膏 1g 磷酸氢二钾 1g葡萄糖酸钾 40g蒸馏水 1000ml上述成分加热溶解、过滤，每支试管分装2ml；15磅15分钟高压灭菌后备用。试剂：班氏（Benedict）硫酸铜试剂。3、方法和结果：直接加1ml班氏（Benedict）硫酸铜试剂于经1824小时培养的葡

18、盐菌液中，充分摇匀，置沸水浴中10分钟，试管中产生棕红色沉淀者为阳性。4、质控菌：阳性菌株：产气肠杆菌； 阴性菌株：大肠埃希氏菌。5、意义：用于肠杆菌科的初步分群。第四节 呼吸酶类及其它酶类试验一、氧化酶试验 （Kovac氏法）1、原理：氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶。它可使盐酸二甲基（或四甲基）对苯二胺氧化而产生颜色反应，生成一种叫做Wurster氏蓝的紫黑色物质。实际上，在做氧化酶试验时，氧化酶并不能直接与氧化酶试剂（1%盐酸二甲基或四甲基对苯二胺）发生反应，而是首先使还原型的细胞色素C氧化成氧化型的细胞色素C；后者再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。因此，该试验的

19、结果又与细胞色素C的存在有关。2、试剂：1%盐酸二甲基（四甲基）对苯二胺 （避光保存）3、方法及结果：取一洁净滤纸片，沾取被检菌的菌落少许，加氧化酶试剂一滴，阳性者立即呈粉红色，继而变为深红色，并于1030分钟内变为紫黑色；阴性者颜色无明显改变。4、质控菌：阳性菌株：铜绿假单胞菌：阴性菌株：大肠埃希氏菌。5、意义：（1）、用于奈瑟氏菌属的鉴定（均阳性）。 （2）、用于肠杆菌科与其它相似菌科的鉴别。6、注意事项：（1）、操作过程中应避免接触含铁物质，否则易出现假阳性；（2）、若菌落本身呈红色，试验结果无法判断时，可于试验时在纸片上滴加氧化酶试剂后，再滴加一滴10%萘酚，此时菌落变为蓝色为阳性；菌

20、落仍为红色为阴性。其原理为：二、触酶试验1、 原理：该试验是测定细菌是否具有过氧化氢酶的一种试验。有的细菌如微球菌科能产生过氧化氢酶，该酶能使过氧化氢分解产生新生态氧，继而形成氧分子逸出试剂而产生气泡。 触酶H2O2 H2O + O O2 2、试剂：3% H2O23、方法：在一洁净载物玻片或平皿盖上滴加一滴3% H2O2，用接种环或接种针挑取被检菌菌落少许，置于3% H2O2中，观察结果。于半分钟内有大量气泡产生者为阳性；无气泡产生着为阴性。4、意义：主要用于微球菌科与链球菌科的鉴别。5、质控菌：阳性菌株：金黄色葡萄球菌；阴性菌株：草绿色链球菌。6、注意事项：、不得使用血琼脂培养基上的菌落，因

21、红细胞内血红蛋白上的铁离子也有触酶作用，可出现假阳性。、尽量使用新鲜菌落，因陈旧培养物易丧失触酶，造成假阴性。三、DNA酶试验 2、培养基和试剂： 培养基：DNA琼脂培养基；试剂：1N HCL。3、方法和结果：将受试菌点种在DNA琼脂平板上，37孵育1824h，滴加1N HCL使覆盖平板表面，于菌落周围出现透明环者为阳性。4、质控菌：阳性菌株：金黄色葡萄球菌；阴性菌株：产气肠杆菌。5、意义：、用于金黄色葡萄球菌的鉴别；、用于肠杆菌科某些属种的鉴别。注：微量反应管检测DNA酶原理在肉汤培养基中加入DNA酶和甲基绿（MG），MG可与长链的DNA结合，形成一种绿色聚合物，故培养基本身呈绿色。当细菌生

22、长后，若能产生DNA酶，则DNA多核苷酸长链被水解成寡核苷酸短链，MG不能与寡核苷酸短链聚合而被游离。游离的MG由绿色变为无色。故试验中培养基由绿色变为灰白色为阳性。如图所示：四、血浆凝固酶试验1、原理：有些细菌如金黄色葡萄球菌在生长繁殖过程中可产生血浆凝固酶。该酶分为两种，一种由细菌产生后，不分泌到菌体外，而是结合在细菌细胞壁上，此类凝固酶又称结合凝固酶或固定凝固酶，也叫凝聚因子。凝聚因子是一种真正的凝固酶，它可使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，后者附着在菌细胞表面，从而使细菌凝聚成团。玻片法凝固酶试验检测的即是凝聚因子。 凝聚因子 纤维蛋白原 纤维蛋白另一种凝固酶由细菌产生后分泌到菌体外

23、。此类凝固酶称游离（分泌型）凝固酶。实际上，这类凝固酶并非是真正的凝固酶，而是一类凝固酶原样物质，它必须在血浆中的凝固酶致活因子（如Ca+）的激活下才能转变为凝固酶样物质，然后才能使血浆凝固。 凝固酶致活因子（Ca+） 凝固酶原样物质 凝固酶样物质 纤维蛋白原纤维蛋白试管法凝固酶试验检测的即是游离凝固酶。 2、方法：（1）、玻片法：在一洁净载玻片上滴加一滴生理盐水，用接种环挑取受试菌的菌落，乳化在生理盐水中，经1020秒确认无自凝后，挑取兔或人血浆一环，混合在乳化菌液中，10秒钟内出现凝集者为阳性。（2）、试管法： 、取小试管三支，分别标以阳性（P）、试验（T）和阴性（N）字样。、其余操作见下

24、表。 3、质控菌：阳性菌株：金黄色葡萄球菌；阴性菌株：表皮葡萄球菌。4、意义：用于葡萄球菌属的鉴定。5、注意：（1）、金葡菌不是唯一能产生血浆凝固酶的细菌。（2）、能产生血浆凝固酶的细菌并非都能同时产生两种凝固酶。五、 胆盐溶菌试验1、原理：本试验是测定细菌能否被胆汁或胆盐溶解的一种试验。有些细菌如肺炎链球菌能被胆汁或胆盐裂解。胆盐溶菌的原理目前尚不完全明了，但多数人认为溶菌的机理有二：一是胆汁（盐）能降低细菌的表面张力，从而促进细菌的裂解；二是胆盐能促进细菌自溶酶的活性，从而加速细菌的自溶。3、质控菌：阳性菌株：肺炎链球菌；阴性菌株：草绿色链球菌。 4、意义：（1）、用于肺炎链球菌与其它甲型

25、溶血性链球菌的鉴别；（2）、用于致病性奈瑟氏菌（脑膜炎奈瑟氏菌）的鉴别。5、注意：（1）、做此试验必须用活菌，胆盐对死菌无裂解作用。 （2）、去氧胆酸钠在酸性环境下易发生沉淀而成胶胨状，故当细菌培养液呈胶胨状时，应先将其pH值调至弱碱性再行试验。六、CAMP试验1、原理：该试验是测定细菌能否产生CAMP因子的一种试验。CAMP因子是一种促溶血因子，它能促进葡萄球菌产生的溶血素的溶血活性，从而在两菌交界处产生扩大的矢状溶血区。由于CAMP因子是由Christian、Atkins、MounchPeterson等人共同发现的，故称CAMP因子。2、方法：取血平板一个，先将呈溶血的金葡菌用接种环在平皿

26、中央或偏下画一横直的接种线，然后再挑取被检菌，在其垂直的位置画一垂线，两线不能相交，应相距3mm。置371824小时，取出后观察结果。若两菌交界处出现矢状溶血区为阳性。3、质控菌：阳性菌株：B群链球菌；阴性菌株：其它群链球菌。4、意义：主要用于B群链球菌和其它群链球菌的鉴别。5、注意：每次最好能以阴、阳性菌株做对照。硝酸盐还原试验1、原理：硝酸盐还原反应包括两个过程。其一是在合成代谢中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其它含氮物质；另一是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。 硝酸盐还原的过程可因细菌种类的不同而异。有的细菌仅使硝酸盐还原为亚

27、硝酸盐，如大肠埃希氏菌等；有的细菌可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌可使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如沙雷氏菌属；有的细菌还可以将其还原产物在合成代谢中完全利用。硝酸盐或亚硝酸盐如果还原生成气体的终末代谢产物如氮或氧化氮，称为脱硝化作用。 2、试剂：甲液：对氨基苯磺酸 0.8g；5N醋酸100ml。乙液：-萘胺0.5g；5N醋酸100ml。用时将甲液和乙液等量混合。 3、方法和结果：接种待检菌于硝酸盐培养基上，培养14天，加入硝酸盐试剂0.1ml,观察结果。立即或于10分钟显红色者为阳性。如欲观察有无氮气产生，可于培养基内加一只小倒管，若有气泡产生，则表示有氮气生成。 4、注意：本试验的阴性反应有三种原因：一为细菌不能还原硝酸盐；二为亚硝酸盐继续分解生成氨和氮；三为培养基不适于细菌生长。 如欲检查培养基中硝酸盐是否被还原，可取锌粉少许加入培养基内，如出现红色，表示硝酸盐仍存在；如不出现红