Western-blot(蛋白印迹法)详细步骤

1、Western blot（蛋白印迹法）详细步骤组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。 研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。 用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。 装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80保存。注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180至少3h以上。 2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。 3.每种样品都最

2、好留有副管，备用。裂解提蛋白准备：裂解液配制比例 RIPA:PMSF=1000：10=100：1 若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1l蛋白酶抑制剂）步骤：将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300500l左右（浓度尽量高点）。 盖好盖子，在冰上裂解3040min. 到时间后于4，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20保存。注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标

3、准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：按1:15或1:30稀释待测样品，即取1l样品+14l水。 按下表在酶标仪中加入试剂，绘制标准曲线。孔号0123456蛋白标准液（l）01246810去离子水（l）10986420蛋白含量（g）01246810按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。每个标准品孔加入200l BCA工作液，样品孔加入待测样品10l和200l BCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37放置30min，于492nm下测定OD值。标准曲线以蛋白含量（g）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。注意

4、：1.标准曲线一般做两组，取最好的标准曲线计算。 2.蛋白浓度=（蛋白含量/总体积）稀释倍数g/l 3.保证样品液中的蛋白含量相同（500g/100l）,则取10l样品液中含有50g蛋白。 4.样品液稀释液要再沸水浴中煮10min（可用微波炉加热），放凉至室温后于-20保存。SDS蛋白质电泳(一)、配胶准备：凝胶液各成分、电泳板、制胶架、梳子步骤:选择适合电泳板（0.75mm:1.0mm:1.5mm），用自来水冲洗干净后再用蒸馏水冲洗，将玻璃板夹入玻璃板夹，注意底部对齐，夹好后卡到制胶架上。 首先配制分离胶（一般用12%的SDS分离胶），按分离胶配方配制，配胶时最后加APS和TEMED，迅速混

5、匀，注意减少气泡的产生。 将配好的分离胶迅速加入玻璃板之间至梳子下约1cm处（绿色线处），不要有气泡。灌好胶后用蒸馏水覆盖胶层，加满蒸馏水至玻璃板顶端，以利于丙烯酰胺的聚合。室温静置约30min至胶层与水层检出现明显界限。若室温过低可将其置于37烘箱中。 配制浓缩胶（5%的Arcymalide浓缩胶），混匀，注意减少气泡产生。 带分离胶聚合后，倒掉上层水，将混匀的浓缩胶沿玻璃板壁小心加在分离胶上至较短玻璃板顶端，插好梳子，不能有气泡，室温静置2030min至凝胶聚合。注意：1.夹好玻璃玻璃板后用水检查其是否漏水。 2.12%分离胶配方：不同体积（ml）凝胶液各成分所需体积（ml）溶液成分510

6、15202530H2O1.63.34.96.68.29.930%Arcylamide2.04.06.08.010.012.01.0M Tris-HCL(PH8.8)1.32.53.85.06.37.510%SDS0.050.10.150.200.250.3010%APS0.050.10.150.200.250.30TEMED0.0020.0040.0060.0080.0100.012 3.SDS浓缩胶配方（5%Arcylamide）不同体积（ml）凝胶液各成分所需体积（ml）溶液成分234568H2O0.681.42.73.44.15.530%Arcylamide0.170.330.670.8

7、31.01.31.0M Tris-HCL(PH8.8)0.130.250.50.630.751.010%SDS0.010.020.040.050.060.0810%APS0.010.020.040.050.060.08TEMED0.0010.0020.0040.0050.0060.008 4.配胶时加入的APS和TEMED是助凝剂，应最后加入，加入后应迅速将配好的胶灌入玻璃板之间，防止其凝固。(二)、电泳准备：电泳仪、电泳缓冲液、样品、marker步骤：取1电泳缓冲液，待浓缩胶聚合完全后，将胶架放入电泳槽内，将电泳缓冲液倒满内槽，内槽电泳液灌满后电泳液自动溢出灌满外槽，内槽电泳液低于外槽，拔出

8、梳子，向梳子孔内加样。 加样量为每孔8l或10l，如有剩余的孔，可加入等体积的1loading buffer上样缓冲液，以防止样品胶跑歪。 marker一般点在最左侧。 将电泳槽与电泳仪连接，打开电泳仪开关，恒压80V预电泳10min至溴酚蓝前沿到达分离胶，将电压调整到恒压120V，电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，注意不要让溴酚蓝跑出分离胶。注意：1.电泳的条带依据蛋白的分子量而区分，分子量大的蛋白跑的慢，在上端。 2.电泳液可回收多利用几次，一周左右。（三）、转膜 准备：甲醇、转膜缓冲液、滤纸、玻璃棒、海绵、PVDF膜或NC膜 步骤：电泳结束后立即转膜防止蛋白分散，剪取一张与凝胶大小相仿的PV

9、DF膜，2块海绵，6张滤纸。 将PVDF膜用甲醇活化约3min，然后将膜、凝胶、海绵和滤纸放在盛有转膜缓冲液的托盘中平衡15min。 取下凝胶用切片切取需要的部分，两端以marker和上样边缘为界，用转膜缓冲液冲洗凝胶几次，在湿转板黑色面放置一张海绵、三张滤纸，再放置凝胶，每一层都要用玻璃棒赶出气泡。 从甲醇中取出活化的膜在转膜缓冲液中浸洗一下，放在胶上，正面朝凝胶，再放三张滤纸、一张海绵，每一层用玻璃棒赶出气泡，最后夹紧转移夹。 转移夹正极板（白色）对着电泳槽红色面，放入电泳槽中通电转膜，恒压72V或恒流300mA。注意：1.20KD以上的蛋白转膜时间约1h以上，100KD的蛋白转膜时间约1

10、.5h左右，10KD左右的蛋白转膜时间为2030min左右。 2.转膜要在冰水浴中进行，避免体系温度过高。 3.操作时要戴手套，用镊子夹持PVDF膜边缘防止划伤膜或染上杂蛋白。 4.PVDF膜可多次曝光（8次左右），NC膜可曝光23次。（四）、封闭 准备：脱脂奶粉、TBST缓冲液步骤：转膜结束后，小心取出凝胶和膜，可在膜上观察到预染marker的条带。 配制5%的脱脂奶粉（5g脱脂奶粉+100mlTBST缓冲液）封闭液，将膜放入盛有封闭液的容器中，室温摇床封闭1h。注意：1.可用考马斯亮蓝将凝胶染色以判断转移情况。 2.NC膜可置于丽春红染色液中，室温下染色5min，用双蒸水洗膜至水变清，无色

11、蛋白条带清晰，说明染色效果好。（五）、一抗孵育准备：抗体、5%脱脂奶粉、自封袋、封口机步骤：根据抗体说明书以适当比例用5%脱脂奶粉稀释一抗。 将自封袋剪去封口条，两边剪开，封闭后的PVDF膜小心放入袋内，通常4号袋可放置34条膜，膜与膜之间用封口机封好，剪开。 加入配好的一抗溶液，小心排除气泡，用封口机封口后正面朝上（与凝胶接触的一面）在摇床上4过夜孵育或室温孵育13h。 孵育后将膜取出，一抗溶液可回收放置-20保存两周回收利用。 用TBST在摇床上洗膜3次，每次5min以去除残留的一抗。（六）、二抗孵育 准备：二抗、5%脱脂奶粉、自封袋、封口机步骤：用5%脱脂奶粉按二抗说明书以适当比例稀释（

12、1:40001:20000）。 按一抗孵育的操作给洗过的膜孵育二抗。 室温摇床孵育2h，孵育后将膜取出，用TBST洗膜3次，每次5min除去残留的二抗。曝光鉴定准备：显影液、定影液、自来水、发光液A、发光液B步骤：在暗室中将定影液、显影液、自来水分别倒入塑料盘中备用。 于一离心管中加入发光液A、发光液B各200l，混匀。 在暗盒内放置一层自封袋，底层可用双面胶粘好，擦净后将漂洗后的膜正面朝上，摆放在塑料膜上，将发光液均匀的滴在PVDF膜上，用另一层塑料膜盖好膜，小心排除气泡。 在暗室中取出一张X光胶皮，用剪刀剪成适当大小，根据肉眼观察到的荧光强弱调整曝光时间，胶片一旦放上不可移动。 通过多次曝光以到达最佳效果。曝光完成后打开暗盒取出X光胶片，浸入显影液中不停摇动显影，在红光下观察出现明显条带（一般约1min），立即浸入定影液中（一般约510min），以胶片透明为止，用自来水冲去残留的定影液，室温下晾干，胶片保存在干燥阴凉处。注意：1.若肉眼即可观察到可见荧光，则只需压片12s，一般压片时间为510min。 2.显影、定影和冲洗可在显影仪中一步进行。六、扫描及分析准备：数码相机、Photoshop、Quantity one软件步