基因工程药物和疫苗课件

1、第二十二章基因工程药物与疫苗Genetic Engineering Drugs and Vaccines Topics基因工程药物和疫苗的概念基因工程药物和疫苗的种类和制备体系基因工程蛋白质（或多肽）药物基因药物基因工程疫苗视频短片Genetic Engineering and Health 基因工程产品（药物和疫苗）运用现代生物技术获取基因将基因转入在体外培养的细胞中，或直接在体内进行大量表达获得的 重组蛋白DNA（或RNA）天然的合成的生物活性更高免疫原性降低毒副作用更低具有治疗作用什么是现代生物技术？现代生物技术主要包括五项技术（工程）基因工程蛋白质工程细胞工程酶工程发酵工程（微生物工程

2、）核心技术基因工程 概念在体外将各种来源的遗传物质（通常是DNA）插入病毒、质粒或其它载体DNA分子，构成遗传物质的新组合，并使之导入到原先没有这类分子的宿主细胞内，而能持续稳定地繁殖。也称DNA重组技术 。目的分离获得某一感兴趣的基因或DNA获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基本原理目的基因的获取重组DNA导入宿主细胞外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达 以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程第一节 基因工程药物和疫苗的种类及制备体系Section Categories and Preparation System蛋白质多肽类药物和疫苗核酸类药物和疫苗

3、基因工程药物与疫苗细胞因子激素抗菌肽酶和酶抑制剂治疗性抗体微生物、寄生虫和肿瘤疫苗裸DNA基因药物反义核酸药物核酸疫苗一、基因工程药物与疫苗的种类二、基因工程药物和疫苗的制备体系运载外源基因的载体宿主细胞目的蛋白表达系统关键运载外源基因的载体常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA宿主细胞要求宿主细胞及其载体的遗传背景清楚，便于进行DNA重组操作；宿主细胞的代谢途径及其调控机制清楚，容易进行代谢调控；容易获得较高密度的细胞培养；能利用廉价而容易获得的原料；产热少、耗氧低，发酵温度适当；产量和得率高，产物容易提取纯化 。宿主细胞分类大肠杆菌枯草芽孢杆菌链霉菌酵母丝状杆菌昆虫细胞哺乳动物细胞原核细

4、胞真核细胞优点：方法简单，经济缺点：不能加工表达的真核蛋白质，表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 优点：可表达真核基因组DNA，可适当修饰表达的蛋白质缺点：操作技术难，费时，不经济三、国内外基因工程药物与疫苗的研发概况国家批准上市的基因工程药物和疫苗销售额美国1411980亿美元(2019年)日本3113000亿日元欧盟2980亿美元(2000年)中国24250亿元人民币(2019年)第二节 基因工程蛋白质（或多肽）药物Section Genetic Engineering Protein and Peptide Drugs 一、细胞因子类药物二、激素类药物 三、抗体类药物四、溶栓和抗凝血药物 五

5、、其他活性蛋白类药物一、细胞因子类药物细胞因子(cytokine)是一类由免疫活性细胞 (淋巴细胞和单核巨噬细胞等 )及其他细胞 （成纤维细胞、内皮细胞等）分泌的具有调节细胞功能的高活性多功能小分子蛋白质。重要的细胞因子类药物1.干扰素( Interferon, IFN )2.白细胞介素( Interleukin, IL )3.集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF)4.肿瘤坏死因子( tumor necrosis factor, TNF ) 5.生长因子( growth factor, GF )1. 干扰素（Interferon，IFN） 性 质: 多功能

6、的细胞因子家 族: 20余成员分 类: IFN-，来源于白细胞、B淋巴细胞和一些肿瘤细胞 IFN-，来源于成纤维细胞 IFN-，来源于T细胞和NK细胞作用: 促进合成多种抗病毒的蛋白，抑制病毒的复制和病毒蛋白的合成具有一定的抗肿瘤作用免疫调节作用临床应用：IFN-：粒细胞白血病和慢性病毒性感染IFN-：多发性硬化症IFN-：类风湿性关节炎干扰素的生产：传统方法：从人血液中的白细胞内提取 每300L血液才能提取1mg 基因工程：将干扰素基因转移到大肠杆菌中 每千克培养液可提取20-40 mg 优点：无污染，安全性高纯度高比活性高成本低疗效确切基因工程-干扰素的生产从人白细胞中克隆出-干扰素基因将

7、此基因与大肠杆菌表达载体连接构成重组表达质粒转化到大肠杆菌中，获得高效表达人-干扰素蛋白的工程菌工程菌经发酵后可收集到大量菌体将菌体破裂，用先进的生物工程手段将-干扰素蛋白从菌体中分离、纯化得到高纯度的人基因工程-干扰素基因工程-干扰素目前我国市场销售的基因工程干扰素根据其来源和分子结构的不同，有-1b, -2a, -2b三种亚型，其中-2a, -2b型为进口产品或国内仿制产品，而-1b型干扰素系采用中国健康人白细胞来源的干扰素基因克隆和表达的基因工程干扰素。PEG化的IFN-2a为了提高代谢半衰期及增强疗效，将IFN进行聚乙二醇(PEG)化。治疗慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎2. 白细胞介素(

8、Interleukin，IL ) 性质：介导白细胞间相互作用的细胞因子，还参与其他细胞的调节，并相互影响，相互制约，由此构成了一个开放的，复杂的细胞因子调节网络。家族：20多成员作用：刺激T、B细胞增殖 增强NK细胞的杀伤活性 促进血小板的生成和促进B细胞产生抗体 IL-2：某些肿瘤和感染性疾病IL-11：血小板减少症临床应用：3. 集落刺激因子(colony stimulating factor , CSF) 性质：参与造血调节过程的糖蛋白分子家族：4个成员来源：免疫活性细胞所产生作用：促进造血祖细胞及其分化 宿主抗感染免疫中起作用包括：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）多能集落刺

9、激因子（multi-DSF、IL-3）巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）粒细胞集落刺激因子（G-CSF）促红细胞生成素（EPO）血小板生成素（TPO）干细胞因子（SCF）临床应用促红细胞生成素（EPO）：治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血和HIV感染治疗的贫血。粒细胞集落刺激因子（G-CSF）：肿瘤化疗引起的嗜中性白细胞减少症。 4. 肿瘤坏死因子 （tumor necrosis factor，TNF ） 性质：对肿瘤细胞具有直接杀伤作用的细胞因子 家族（TNFSF）：成员20个受体家族（TNFRSF） ：成员20个包括：TNF-及其衍生物淋巴毒素（TNF- ）及其衍生物FasL（Fas配体）肿瘤坏

10、死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）LIGHT血管内皮细胞生长抑制因子（VEGI）作用： 细胞增殖、分化 基因激活 细胞毒性和凋亡 宿主防御和炎症反应 自身免疫，器官形成和免疫调节应用： 治疗用蛋白 治疗基因 抗体 小分子的靶位可治疗多种疾病，如肿瘤，类风湿性关节炎，红斑性狼疮等。5.生长因子( growth factor, GF ) 生长因子来源治疗bFGF基因工程烧伤和外周神经系统疾病NGF小鼠周围性神经炎VEGF基因工程肢体缺血基因治疗IGF-I基因工程II型糖尿病、骨质疏松症和肌萎缩性侧索性神经炎临床试用的生长因子 体内对不同细胞具有促进生长作用的细胞因子二、激素类药物性质: 由内分

11、泌细胞分泌的高效能活性物质分类: 多肽类和类固醇类目前已批准上市的激素类药物 激素来源治疗胰岛素基因工程治疗胰岛素依赖型 (型 )糖尿病生长激素基因工程促生长，治疗侏儒症促卵泡激素基因工程下丘脑-垂体功能障碍和多囊卵巢综合症甲状旁腺激素基因工程调节血钙、血磷治疗骨质疏松症三、抗体类药物（一）抗体药物研制的现状： 治疗性单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）技术是当前国际生物技术领域开发的热点。有着广阔的发展前景。单克隆抗体（或将单克隆抗体与抗癌药物结合），被称为威力强大的抗体“生物导弹”。把这种抗体“导弹”注射到癌症患者的血液中，它就会发挥导弹样的作用，在患者体内追踪并附

12、着于癌细胞上，然后导致癌细胞被免疫细胞识别而被杀伤、吞噬或者使与抗体结合的抗癌药物杀伤和破坏癌细胞，而且很少损伤正常组织细胞。优点：高度选择性，对癌细胞命中率高，杀伤力强。FDA已批准上市的部分单抗药物产品名称 适应症 目标 抗原 批准 年份 抗体 类型Oothoclone异体移植CD31986鼠源抗体Panorex肿瘤17-1A2019鼠源抗体Rituxan非何杰金淋巴瘤CD202019嵌合抗体Remicade类风湿性关节炎TNF-2019嵌合抗体Herceptin乳腺癌HER2/neu2019人源化抗体Mylotarg白血病CD332000人源化抗体（二）基因工程抗体定义：在基因水平上，对

13、抗体分子进行切割、拼接或修饰，或将人工全合成的抗体基因导入受体细胞表达，产生新型抗体。举例： 人-鼠嵌合抗体(chimeric antibody) 改型抗体 (reshaped humanized antibody) 小分子抗体 双特异性抗体(bispecific antibody)（三）全人单克隆抗体:人-人杂交瘤技术由一个识别单一抗原决定簇（表位）的B细胞克隆所产生的同源抗体。单克隆抗体 表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体的特点与应用特点：纯度高、专一性强、与抗原结合的特异性强，便于人为处理和质量控制。应用：(1)诊断试剂；(2)治疗药物：因为单抗毒性低

14、，抗体本身既可被当作一种治疗药物，也可被用作传递药物的一种载体。 鼠源性抗体 嵌合抗体（人鼠） 人源化抗体（人鼠） （含全套人抗体重链和轻链V区基因） 全人抗体（人） 单克隆抗体发展过程及方向接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡短命细胞。单克隆抗体的制备杂交瘤技术产生的3个技术关键1. B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：B淋巴细胞(B lymphocytes)：骨髓瘤细胞 (myeloma cells):恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活长命细胞。经筛选与驯化，现已建

15、立多种骨髓瘤细胞株没有抗体分泌物。2. 细胞融合技术：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞长命不分泌抗体分泌抗体短命分泌抗体长命Khler和Milstein, 19751984年Nobel医学奖3. 杂交瘤细胞的筛选 ：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞/脾细胞骨髓瘤细胞/骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞筛选出不能长期存活不能长期存活HAT培养基筛选H, 次黄嘌呤; A, 氨甲喋呤; T, 胸腺嘧啶H外源性途径(旁路途径) (Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase) 次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT )胸腺嘧啶激酶 (

16、 TK )(Thymidine kinase)B淋巴细胞： HGPRT+， TK+骨髓瘤细胞： HGPRT-， TK-存活死亡T外源性途径(旁路途径)内源性途径(主要途径)DNA核苷酸核糖氨基酸A全人单克隆抗体:人-人杂交瘤技术原理 将人B细胞与人骨髓瘤细胞株进行融合，经培 养和筛选后获得全人mAb。优点 副作用更小 无需抗体分子结构的再加工 生产工艺简单，产量高（达20070 mg/L） 与人体内天然抗体完全一致四、溶栓和抗凝血药物 激活血浆纤溶酶原 形成有活性的纤溶酶 催化纤维蛋白发生水解使血栓溶解 溶栓药物的作用机理正在研究的主要溶栓药物 产品名称 作用机制表达细胞现状(国外/国内)SK

17、在血栓部位形成三元复合物激活纤溶酶原真核上市/上市SAK形成SK-纤溶酶复合物原核上市/t-PA与血浆中的纤溶酶原形成复合物原核上市/bat-PA作用于血栓中纤维蛋白真核临床研究/水蛭素hirudin直接抑制凝血酶原核上市/临床研究五、其它活性蛋白类药物 例如，可溶性受体和粘附分子（CD分子）都是人体自身分子，治疗中不易引起免疫应答反应。重组可溶性受体 改造受体的胞外区，使其保留与配基结合的能力，但又失去信号转导的作用。可与配基竞争与受体的结合，发挥受体阻断剂的作用。粘附分子 将粘附分子在体外表达成可溶性分子，发挥细胞粘附的阻断作用，治疗因粘附分子功能异常导致的疾病 。抗菌肽类药物抗菌肽是许多

18、生物物种基因组编码的一种内源性抵御病原微生物的生物活性短肽。迄今已从昆虫、两栖类、哺乳动物等数科生物物种中分离出几百种抗菌肽。抗菌肽由于其特殊的抑菌机制及抗菌谱广、高效、不易产生耐药性等优点，有望成为新一代抗菌药物及生物防腐剂。如，研究结果公布在自然杂志上（Nature，2019，437：975980）上的菌丝霉素具有较强的抗革兰氏阳性菌作用，其抗肺炎链球菌感染的疗效与现有抗生素相当。 第三节 基因药物Section Gene Drugs基因药物一是指将具有治疗意义的DNA重组载体，直接转移至人体细胞，在体内表达出具有治疗作用的多肽和蛋白质，这实际上就是基因治疗。二是应用直接作用于细胞内DNA

19、或RNA、抑制基因复制和表达的核酸片段或其人工合成的类似物，以及对RNA具有特异切割作用的核酶等。包括：反基因药物反义寡核苷酸反义RNA小干扰RNA肽核酸核酶反基因药物即反义DNA。是通过与靶基因结合形成三螺旋，并且位点专一性地干扰DNA和蛋白的结合、激活子的转录起始或转录延伸等，进而阻止基因转录和复制。反义寡核苷酸（ODNs）通常指进行了某些化学修饰的短链核酸（约15-25个核苷酸组成），它的碱基序列与特定的靶RNA序列互补，进入细胞后可与靶序列形成双链结构。反义寡核苷酸与靶基因的RNA结合后可通过各种不同的机制影响靶基因的表达。反义RNA根据核酸杂交原理设计的针对靶RNA(多为mRNA)具

20、有互补序列的RNA分子。通过与靶RNA互补结合的方式，从而抑制特定基因的表达。小干扰RNA（siRNA）指人工合成的或在细胞内表达的短双链RNA（21-23 nt）。这种双链RNA可诱导序列特异的（同源性的）目标基因的沉寂，抑制细胞内特定基因表达。肽核酸（Peptide nucleic acid，PNA）是一种与DNA和RNA相似的化学物质，可经由人工合成制造，用来作为生物学研究或是医学治疗。PNA的骨架是由重复排列的N-2-(氨乙基)-甘氨酸单位，经由肽键所组合而成，4种碱基为侧链，且碱基与骨架之间是以亚甲羰基相连。由于PNA没有如DNA或RNA上的磷酸基团，因此PNA与DNA之间缺乏电性相

21、斥的现象，使两者之间的结合强度大于DNA与DNA。PNA与靶DNA结合后，对转录可发挥正负两方面的调节作用，分别实现对转录的序列专一性的终止或者启动。核酶具有催化活性的RNA。最简单的核酶二级结构锤头状结构底物部分通常为60个核苷酸左右同一分子上包括有催化部份和底物部份 催化部份和底物部份组成锤头结构 人工设计的核酶粗线表示合成的核酸分子细线表示天然的核酸分子X 表示一致性序列箭头表示切断点第四节 基因工程疫苗Section Gene Engineered vaccines疫苗传统疫苗灭活疫苗减毒疫苗亚单位疫苗新型疫苗基因工程疫苗基因工程疫苗(gene engineered vaccine)是

22、指通过重组DNA技术克隆表达保护性抗原基因，利用表达产物或重组体制成的疫苗。包括基因工程亚单位疫苗、基因工程载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗和蛋白质工程疫苗等。保护性抗原：是指病原微生物的能刺激机体发生保护性免疫应答的抗原成分。按照使用目的分为：病毒疫苗细菌疫苗 寄生虫疫苗 肿瘤疫苗基因工程疫苗1.基因工程亚单位疫苗 (gene engineered subunit vaccine)基因工程表达的蛋白抗原。免疫原性好可消除病毒潜在的致癌性 可大量生产特点一、病毒疫苗例如基因工程乙肝疫苗2. 载体疫苗(vectored vaccine ) 将保护性抗原基因重组到减毒或无致病性的微生物(载体)中，

23、当这类微生物感染机体后可表达相应的保护性抗原。特点多为活疫苗接种后可在体内大量产生目标抗原常用的载体痘病毒、腺病毒载体、卡介苗3. 核酸疫苗( nucleic acid vaccine ) 用编码保护性抗原的基因制成的疫苗特点易于制备便于保存可多次免疫可制成多联多价疫苗4. 基因缺失活疫苗 (gene deleted live vaccine) 通过基因缺失突变使得病毒的毒力降低或消失且不引起抗原性改变所制备的基因工程病毒活疫苗。特点突变性状明确稳定 5. 蛋白质工程疫苗 （protein engineered vaccine) 通过基因突变、抗原构型改变，或将不同基因或结构域融合构成的疫苗。

24、特点免疫原性增强副作用降低二、细菌疫苗传统疫苗灭活菌苗减毒活菌苗亚单位或成分疫苗缺点效价不够高需要多次免疫 新的细菌疫苗 通过构建突变株、构建重组细菌载体、人工合成多肽和制备核酸疫苗等途径来获得的细菌疫苗霍乱菌苗痢疾菌苗 伤寒杆菌疫苗幽门螺杆菌疫苗结核杆菌疫苗肠出血性大肠杆菌菌苗 例如1. B亚单位-全菌体菌苗（BS-WC）：这是由灭活的霍乱弧菌全菌体细胞（WC）和纯化的霍乱肠毒素B亚单位（BS）组成的菌苗。其中WC细胞壁含有的抗原，能诱导机体产生抗菌抗体，从而抑制霍乱弧菌在肠道定居；而BS产生的抗毒抗体，使霍乱肠毒素不能发挥作用。此菌苗保护率为65%85%左右，对古典生物型霍乱弧菌的预防作用优于埃尔托生物型霍乱弧菌。 2. 减毒口服活菌苗CVD103-HgR：这是应用DNA重组技术将除去94%的CtxA基因（霍乱毒素A亚基基因），重组于古典生物型霍乱弧菌的569B株中，获得减毒株CVD103，然后在染色体上导入一个抗汞（Hg）的编码基因作为筛选标记，成为CVD103-HgR减毒株。保护率为88%左右。 一般认为保护作用至少持续6个月。霍乱菌苗三、寄生虫疫苗例如 疟疾疫苗我国研制的PfCP-2，使用酵母为载体高效表达新的疫苗抗原。四、肿瘤疫苗（cancer vaccines） 利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导