乳酸菌调研报告

1、乳酸菌调研报告乳酸菌是指碳水化合物（即糖类等）经过发酵，获得能源所生成大量的乳酸菌群的总称。它的繁殖如同人类一样，需要很多的营养物质。因此，乳酸菌主要存在于动植物及食品当中与人类的生活息息相关。乳酸菌从形态上粗分为杆菌和球菌，在分类学上分为12属以上的属类中，到目前为止，已被证实有250种以上。乳酸菌一般不会运动，在自然界中种类多，分布广。到目前为止，这类细菌共发现了59种，分别归属于乳链球菌及乳杆菌两大家族。随着高新技术的不断发展和人类社会的日益进步，乳酸茵对人体健康的有益作用，越来越受到社会各界特别是研究领域和生产企业的广泛关注。因此，乳酸菌的开发利用具有了重要的意义。乳酸菌菌种特性不同属

2、的乳酸茵在冷冻、干燥和保藏过程中表现出不同的特性。早先有报道细菌细胞形态、尺寸大小对其在冻干后的存活率有影响。例如,肠球菌属一种小的球形细胞。对冻干的抵抗力明显强于乳酸杆（棒）菌属。据Fonseca等研究，在冷藏和冷冻干燥过程中,由于细胞外冰晶的形成,细胞的表面积越大,细胞膜破坏越严重。在相同的外部条件下,同种菌的不同菌株在冻干及固体状态下保藏也可能表现出不同的特性。乳酸菌的这些特性还不十分清楚,有待于一步研究,目前有人提出一些假设来解释这一现象:1）不同菌株遗传物质的差异导致菌株有不同的表现型,这种差异性引起细胞对冷冻干燥的不同抵抗力;2）不同菌株的细胞壁和细胞膜组成成分不同以及磷脂的熔点不

3、一样,也能引起细胞特性不同。乳酸菌的功能乳酸菌具有强抗酸能力，如在含糖丰富的食物制作中，虽然其他很多的菌类也能生长，但因乳酸菌不断地产生乳酸使得环境变酸而杀死多种不耐酸的细菌。大部分乳酸菌具有很强的抗盐性，都能耐5以上的NaCl浓度。如嗜盐链球菌甚至能在浓度为1518的盐水中生存。这样在腌制品中其他不抗盐的有害菌不能生存而独有乳酸菌能正常生长，增加了食物的风味。据最近几年研究资料表明乳酸菌作为定居肠道中的有益菌群具有以下几种功能。1.1具有营养作用乳酸菌利用可发酵糖，产生酸味柔和的乳酸、醋酸、丙酸等有机酸及醇、醛、酮多种风味物质。它们在赋予制品酸味的同时，使制品具有更佳的风味。食品原料经乳酸菌

4、发酵后，能使其蛋白质、脂肪和糖类改善性质或分解为人体所更易消化吸收的状态，同时还能增加可溶性钙、磷、铁和某些B族维生素的含量，提高它们的消化吸收性能和营养价值。1.2改善肠道的作用乳酸菌进入人体消化道后，可在肠道内繁殖，产生乳酸、乙酸和一些抗菌物质，使肠道的pH值和氧化还原电位降低，从而能抑制致病菌和有害于人体健康的有害菌的生长繁殖，可起到抗菌防病的作用。同时，乳酸菌的大量生长繁殖也维持了肠道菌群的平衡，起到了整肠作用。13抗肿瘤作用一些乳酸菌如双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等能耐受胃部不利的酸性条件而到达肠道，这些菌能抑制一些结肠中的细菌酶，特别是那些能促进前体致癌物向致癌物转化的酶。另外，致癌作用是

5、通过致癌物诱导动物细胞突变开始的，一些乳酸菌可抑制动物细胞的突变。其作用的方式是抑制致突变的酶的活性及对一些致癌物本身的抑制。活性的降低就意味着致癌物形成机率的减少。如前所述，到达肠道的乳酸菌在肠道内进行发酵，降低了肠内pH值，增加了肠的蠕动，使肠道内的致癌物及其前体能尽早排出体外，降低其发病可能性。14降低胆固醇作用乳酸菌菌体成分或菌体外代谢物有抗胆固醇因子。乳酸菌的代谢能显著减少肠管对胆固醇的吸收，同时，乳酸菌吸收部分胆固醇并将其转变为胆酸盐排出体外。实验证明，用乳酸菌发酵的乳清饲养老鼠6周后，与对照组相比，血清胆固醇值最低，且有较高的GSHPX活性。红细胞中的抗氧化酶(SOD和Catal

6、ase)活性最高。15增强免疫力的作用摄入特定的乳杆菌可以增强机体的免疫反应，增强宿主对肠道感染的抗性。研究认为摄入的乳杆菌可以激活巨噬细胞，巨噬细胞可破坏机体中的病原微生物免疫系统的增强增加了宿主的防御能力，这是益生菌用于保健食品控制肠道感染的主要理论依据。2乳酸菌的应用在食品工业上，主要利用乳酸菌的发酵作用来生产发酵食品，经过乳酸菌发酵的食品具有货架期长、风味独特、营养丰富、易消化吸收等特点。用于食品保藏、防腐乳酸菌发酵产生的主要代谢产物乳酸，对食品有防腐的作用。此外，在发酵过程中还产生一些抑菌物质如乳链球菌肽、乳杆菌素、嗜酸菌素等，可抑制引起食品腐败的微生物的生长，因而提高了产品的可保藏

7、性，延长了货架期。研究表明，许多乳酸菌在食物基质中可产细菌素，可抑制腐败菌或致病菌，是由于细菌素是低分子量的肽或蛋白质，它们可抑制有较近亲缘关系的革兰氏阳性菌。在食物基质中原位产生细菌素可增加产生菌的竞争力并有助于食品防腐。例如，产细菌素乳酸菌作为硝酸钾的替代物用于防止由于梭菌污染而造成的奶酪后损失此外，许多细菌素对于食物中的病原体也能起抑制作用。2.2改善食品的风味乳酸菌在发酵中产生的乳酸、醋酸、丙酸等有机酸，赋予食品柔和的酸味，同时还可与发酵中产生的醇、醛、酮等物质相互作用，形成多种新的呈味物质。此外，乳酸菌还能分解蛋白质（乳酸菌含蛋白分解酶）产生呈味物质肽与氨基酸，兼可消除某些原料带来的

8、异味和怪味。因而经乳酸发酵的食品都具有其独特的风味。2.3加工乳制品传统的食品如酸奶、奶酪是通过乳酸菌发酵产生的。利用乳酸菌发酵牛奶等乳制品，其历史悠久。但是，近几年国外（俄罗斯、波兰和日本等）利用双歧乳杆菌生产乳制品甚为活跃，利用双歧乳杆菌发酵乳制品具有醇美的酸味，无苦味，含有生理价值的左旋乳酸，使食用者肠道具有有益菌的特点，但有一定的醋酸味、酸生成缓慢、pH低、双歧乳杆菌易死亡等缺点。因此，在牛乳发酵中采用双歧乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌混合发酵。改用此种乳制品可以治疗消化不良、胃肠炎、便秘等。乳酸菌在干酪的生产中，通过产酸有凝乳作用，乳酸菌的自溶也可以使大量的胞内酶得以释放，加速干酪的

9、成熟过程，缩短成熟周期，降低成本，提高生产效益。2.4腌制菜类食品酸菜的酸味是由乳酸菡产生的。在制酸菜的过程中，乳酸的产生菌主要是黄瓜发酵乳酸茵、胚芽乳杆菌和短乳杆菌等，若接入适量优良的乳酸菌，能提高腌菜的芳香味，改善酸菜的风味及保藏性，低盐渍物含食盐1以下时，用012的乳酸进行补充，能防止产膜酵母及醋酸菡的异常增加，抑制异臭的发生。最近，日本在应用乳酸菌开发一种新产品Km,是以乳酸菌为主体的微生物发酵后急速冷冻干燥的成品。Km对渍物有pH缓冲作用，保持食品pH稳定；防嫌气性有害细菌的增殖，改善溃物香味、风味、除去原料生成的生臭味，保持食品色与新鲜度，还可防止由有机酸造成的食品中蛋白质、维生素

10、、胡萝卜素、叶绿素的损耗，能使腌渍物色、香、味、体综合质量明显提高。2.5发酵制作酒类在白酒的酿造过程中，有部分乳酸菌（链球菌和乳杆菌）参与。乳酸菌利用糖类生成乳酸，在酶的参与下，乳酸与乙醇酯化，形成乳酸乙酯，丰富白酒风味，提高白酒的品质。在葡萄酒的贮存过程中，由于明串珠菌等乳酸菌的生长繁殖，使葡萄酒中的主要酸之一苹果酸，发生脱羧基作用，生成乳酸，这种发酵可降低葡萄酒的酸度，特别是在低温地区酿制葡萄酒，这种发酵更为必要，由于经过苹果酸乳酸发酵，风味更好。在啤酒的酿造过程中，乳酸菌产乳酸可以用来生产酸化麦芽和酸化麦汁，经过生物酸化处理的啤酒具有较浅的色度，较多的含氮物质和非常适宜的多酚组成这些多

11、酚与含量较高的还原物质共同作用而使啤酒具有良好的抗氧化性能，并且会使啤酒的口味柔和，具有杀口感。而且经生物酸化可以提高酿造用水的酸度、淀粉酶的活性和啤酒的最终发酵度，有利于蛋白质的酶解，改善麦汁的过滤性能，提高啤酒的非生物稳定性和生物稳定性。米酒是低度饮料酒，口感醇和，富含多种氨基酸及其营养成分。发酵米酒的细菌以乳酸菌为主，米酒中的酸味主要来源于乳酸菌所产生的乳酸，另外乳酸与乙醇反应生成酯类是米酒重要的风味物质，同时乳酸菌代谢过程中也产生乙醛和双乙酰，赋予米酒特殊的风味。控制乳酸菌的数量不但能够缩短米酒发酵周期，同时也能控制米酒生产中质量的稳定性。2.6酿制酱油、醋等调味品在酿制酱油过程中，人

12、工接种乳酸菌能使酱油香气浓、风味佳、质地好。据日本研究，酱醪中细菌主要是乳酸菌，不仅能在曲中生长繁殖，而且能促进酱醪成熟，能分解葡萄糖生成乳酸，生成的乳酸再与酵母生成的乙醇反应生成酱油的特殊香味物质乳酸乙酯。乳酸菌与鲁氏酵母加入酱醪中能增加酱醪中的正丙醇、异丁醇、氨基酸含量提高酱味香。近年来，国内对提高酱油风味的研究表明，添加乳酸菌的途径，归纳起来有：一是利用混合曲；二是利用糖液培养耐盐产酯酵母和乳酸菌，最后配人低盐固态发酵的酱油内，以提高其香味；三是在发酵后期温度降至35C左右，把耐盐酵母和乳酸菌均匀地接入酱醅中，继续发酵。结果以上途径都取得了不同程度的增香效果。醋的酿造主要以淀粉为原料，液

13、体深层发酵制醋时，加入乳酸菌和酵母菌提高风味。乳酸菌代谢产生的有机酸、双乙酰及其衍生物是食醋中主要的风味物质。另外乳酸菌产生的低级脂肪酸、羰基化合物两者的香气成分成为一体，形成较复杂的香气，所以利用乳酸菌和酵母菌协同发酵，醋的风味好，营养价值较高。总之，利用乳酸菌提高酿造和发酵食品的风味越来越引起了国内外人们的重视。乳酸菌的应用也随着研究技术的不断进步涉足领域越来越广泛。相信今后乳酸菌的应用将更上一台阶。乳酸菌的冷冻干燥乳酸菌(lacticacidbacteria)是一类可发酵碳水化合物，主要生成乳酸的细菌总称,自古以来被人类作为食品微生物利用,广泛用于发酵乳制品、豆制品、肉制品、水果、蔬菜、

14、黑麦粉制成的面包等。为了使菌种在长期的传代过程中保持稳定的生存能力和功能活性,保藏方法一般采用冷藏和冷冻干燥技术。冷冻干燥技术是制备和保藏生物材料最有效的方法之一冻干是冷冻和干燥技术的有机结合,但是由于受到冷冻和干燥两种激烈因素的影响,细胞损伤是不可避免的。例如,蛋白敏感性的改变以及细胞生存能力的下降。冻干菌种生存能力的丧失是由于细胞在几个靶位点即细胞膜、细胞壁及质粒DNA的损坏造成的。提高乳酸菌在冻干和长期储藏过程中的存活率在科技和经济上都是十分重要的。微生物细胞的存活率在整个冻干和储藏过程中受很多因素影响。目前有关乳酸菌冻干保藏相关影响因素的研究人们已经做了大量的工作。本文就国内外一些有关

15、乳酸菌冷冻干燥影响因素,如菌种自身性质、生长因素、亚致死处理、保护介质和复水条件的研究和进展情况综述如下：3.1冷冻干燥原理物质中所含水分以两种方式存在：(1)游离水即机械结合水和物化结合水；(2)结构水，即以化学结合方式存在于物料的组织中。冷冻干燥主要是升华游离水，而不是结构水。升华游离水是先将它冻结成冰，然后在真空中加热升华。当压力增加时，冰的熔点降低。三相平衡点时表示在这个温度和压力时，冰、水、汽三相同时共存。此时它的精确温度是0.0098C(近似0.01C),压强为610.5Pa。显然，当压强低于610.5Pa时，不管温度如何变化，只有固态和气态。压力和温度低于三相点时,物质可由固相不

16、经液相直接变为气相,这个过程即为升华。例如将-40C冰面上的压力降低到1.33Pa,则水即从固态的冰直接变为水蒸汽。同理，如将-40C的冰在13.33Pa时加热到.20C。也能发生升华现象。所以在此条件下升高温度或降低压力都可打破两相平衡，使整个系统朝着冰转交为水蒸汽的方向进行。冷冻干燥就是根据这个原理，使冰不断变成水蒸汽，将水蒸汽抽走最后达到干燥的目的。真空冷冻干燥步骤产品的预冻：预冻必须在升华干燥前把所有产品冻实。预冻温度低于共晶点10C左右即可，对于无条件检测共熔点的企业可将最低温度定为.35C左右，预冻时间一般在2-4h之闻这一阶段要考虑到冻干产品的质量和冻干的经济性，需要对降温速率进

17、行控制，因为产品冻干后的外观与预冻过程中降温快慢有关。如慢冻后晶格较大，冰晶呈六角对称型，有利于提高冻干效率；而速冻则呈树枝不规则成型或呈球型，间隙小，升华时阻力大，不利于冻干。因此这一阶段所形成的晶型结构要合理，易升华，并且确保冷冻的产品温度在共熔点温度以下，产品完全冻实，否则真空升华时，会发生沸腾或鼓泡现象。升华干燥：即第一阶段干燥。升华前必须在30rain使冷凝器温度达到-40C以下（一般在.50C最为经济）。开启真空泵，然后将冻干箱与冷凝器之间的大蝶阀缓缓打开，待冻干箱内真空度达到10Pa左右转入加热升华干燥。真空度太低会影响升华速率，一般可控制在20-40Pa。开启油加热器，后开循环

18、油泵，使油液在搁板内循环加热。这一阶段要注意：产品冷冻的温度应低于产品共晶点温度并确保产品冻牢。超过共晶点，将会造成融化降解，色级加深，含量减低，如氨苄西林钠在冻干过程的主干燥阶段一直保持低温状态，二期干燥阶段由于真空度降低，可升高搁板温度使产品温度升高，但必须低于其崩解温度，这样有利于减低残留的少量水分。解析干燥：即第二阶段干燥。该阶段的干燥温度上升到设定的最高温度。各板层制品温度达到加热最高温度，其曲线基本一致，继续保温干燥一段时间，干燥过程即可结束。冻干结束时，以冻干箱内真空度变化幅度，决定产品水分的高低，找出压力升高值和水分的对应关系，即可自动控制产品水分达到要求。若选用冻干机一定，冻

19、干不同产品设定的压力升值相同，产品的水分不同：同一产品加入的料液量不同，要想使产品水分控制相同，压力升值不同。乳酸菌冷冻干燥保护剂冷冻干燥是一个多步骤过程，会产生多种应力使样品交性，如低温应力、冻结应力和干燥应力。冷冻干燥过程会造成乳酸菌的细胞膜通透性改变、蛋白质变性失活、pH的动态平衡被破坏、DNA损伤和膜脂肪酸组成发生改变等。在发酵剂的生产过程中，不适当的冷冻干燥处理过程会造成产品发酵活力降低，产品质量不稳定：因此，为了保护产品的活性，通常在冻干过程中采取保护措施。3.3.1冷冻干燥对细胞的损伤机理冷冻干燥对蛋白质的影响。蛋白质的折叠与展开状态的平衡受周围物理环境（如温度、溶剂组成、水合水

20、平等）的影响很大。干燥过程中蛋白质失水，使原来与水形成的分子问氢键断开，多肽链展开，造成蛋白质变性而失去生物活性。冷冻干燥分为冷冻和干燥两步，其中冷冻与干燥引起的蛋白质变性的机理各不相同在冷冻过程中蛋白质的变性机理包括低温变性和冷冻变性两类。Shikama和Yamazaki于2000年首先开始定量研究低温对蛋白质模型的影响，他们研究发现牛肝过氧化氢酶在不同的低温条件下活性保留程度不同。低温能够引起变性的原因是：非极性基团在水中的溶解度随温度的降低而增加，从而导致蛋白质中的疏水作用减弱。冷冻变性主要受浓缩影响、冰水界面的影响、pH值变化的影响和相分离的影响。对不同蛋白质来说，这些影响可能同时起作

21、用，或只有部分因素起作用。冷冻干燥对细胞膜的影响。一冷冻干燥会造成微生物细胞膜的损伤（其中包括机械损伤、溶质损伤、细胞膜渗透性损伤、DNA损伤导致蛋白质变性失活），pH的动态平衡被破坏，以及细胞膜脂肪酸组成的变化。这些损伤多是通过膜脂性质、结构的变化使膜的流动性或完整性发生改变，从而导致膜的功能失调。通常细胞膜中磷脂的极性端常以水合形式存在，而且每个磷脂的极性端与其它磷脂分子的极性端被水分子隔开。当磷脂干燥脱水时，极性端除去水合氢键，迫使酰基聚集在一起，使极性端的密度增加，范德华力增强，平时处于液晶态的脂膜变成凝胶态；复水时细胞膜的通透性增加，胞内一些可溶性物质发生渗漏，细胞膜内外失去离子平衡

22、，从而导致细胞死亡。冻干过程中，细胞膜脂肪酸的不饱和度、脂肪酸链的长度、链的分支状态或环绕状态都存在着动态变化，脂肪酸的这些动态变化与膜的流动性密切相关。3.3.2保护剂的作用对于细胞在冻干过程中的低温保护，目前被广为接受的液体状态下蛋白质稳定的机理之一是优先作用原理，指蛋白质优先与水或水溶液中的保护剂作用。在有起稳定作用的保护剂存在的条件下，细胞膜蛋白优先与水作用（优先水合），而保护剂优先被排斥在蛋白质区域外（优先排斥），在这种情况下，膜蛋白表面就比其内部有较多的水分子和较少的保护剂分子。优先作用原理同样适用于冷冻一融解过程，蛋白质保护剂在溶液中被从蛋白质表面排斥，在冻结过程中能够稳定蛋白质

23、。但是优先作用机理不能完全解释用聚合物或蛋白质自身在高浓度时保护蛋白质的现象；在冻干过程中，由于蛋白质的水合层被除去，优先作用机理不再适用。对于冻干保护机理，仍在研究探讨之中。目前主要有两种假说：1、水替代假说许多研究者认为。由于蛋白质分子中存在大量氢键。结合水通过氢键与蛋白质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，保护剂的羟基能替代蛋白质表面的水的羟基，使蛋白质表面形成一层假定的水化膜，这样可保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中。从而稳定蛋白质的高级结构，防止蛋白质因冻干而变性，使其即使在低温冷冻和干燥失水的情况下，仍保持蛋白质结构与功能的完整性。2、玻璃态假说玻璃化是指物质以非晶

24、态形式存在的一种固体状态，粘度极大，一般为(101.2101.4)PaS,是固化了的液体，但由于粘度大，分子运动受到限制，流动性差；液体被固化成玻璃态时的温度IgPTg。如果初始浓度较高，且降温速率很高，溶液来不及析出冰，冻结过程中，溶质不出现结晶析出现象，而是趋向一种由液态一橡胶态一玻璃态的转变。研究者认为，在含保护剂溶液的干燥过程中，当浓度足够大且保护剂的结晶不会发生时，保护剂一水混合物就会玻璃化。研究发现在玻璃态下，物质兼有固体和流体的行为，粘度极高。不容易形成结晶，且分子扩散系数很低。因而具有粘性的保护剂包围在蛋白质分子的周围，形成一种在结构上与玻璃状的冰相似的碳水化合物玻璃体，使大分

25、子物质的运动受阻，阻止膜蛋白的伸展和沉淀，维持蛋白质分子三维结构的稳定。从而起到保护作用目前大部分学者赞同“水替代假说”，因为可以通过实验检测到膜蛋白和保护剂之间的氢键作用。为理论提供证据。事实上，无论是“水替代假说”还是“玻璃态假说”，它们的基础都是基于细胞实现了部分或全部玻璃化冻结。3.3.3冷冻干燥保护剂种类保护剂可以改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性。冻干保护剂不仅影响冻干过程中的细胞存活率，还影响到保藏期间蛋白质及细胞的稳定性。冻干保护剂可按照不同的方式进行分类。按其是否能渗到细胞内部，可分为渗透型

26、和非渗透型两种。按其是否能通过细胞壁或细胞膜，又可细分为：(1)既能透过细胞壁又能透过细胞膜的保护剂(如甘油)；(2)fig透过细胞壁但不能透过细胞膜的保护剂(如单糖、部分双糖、氨基酸)；(3)不能透过细胞壁和细胞膜的保护剂(如海藻糖、多糖、聚乙二醇等)126。渗透型保护剂在溶液中易结合水分子，通过水合作用使溶液的粘性增加，弱化了水的结晶过程，从而达到了保护细胞的目的。各种保护剂的使用浓度、渗入细胞的能力，以及对水分子活性的影响等各不相同。非渗透型保护剂不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，即可在特定温度下降低溶质浓度，从而起到保护作用。根据其化学性质，保护剂又可分为多羟基化合物、糖类、氨基酸、聚

27、合物、蛋白质等几大类。4影响乳酸茵冻干发酵剂活力及储藏稳定性的主要因素4.1菌种悬液的浓度在冻干技术中，为了保证在长期保藏后有足够数量的活细胞，通常采用浓度较大的菌悬液，细菌和放线菌浓度一般要大于108CFU/mL,酵母菌细胞和霉菌抱子的浓度大于107CFU/mL，这样在菌种复活时只要能保证有0.1%的细胞仍然有活力就可以完成菌种传代过程。但是Costa等也有报道冻干培养物的最佳浓度与保护性培养基相关，例如当保护培养基中加入蔗糖时，冻干培养物浓度以1010CFU/mL最佳，而保护性培养基中加入脱脂乳时，培养物最佳浓度为108CFU/mL281。Palmfeldt等也报道了当在保护培养基中增加蔗

28、糖浓度时，可以降低茵悬液的浓度，以达到最高的细胞存活率【29】。冻干菌种材料的菌龄冻干菌种材料的菌龄对其在长期真空冷冻干燥保藏后的细胞存活率有重要影响，例如鼠李糖乳杆菌在生长稳定期进行冷冻干燥，其菌株细胞存活率最高为31%.50%，而在对数生长期为14%，在延滞期仅有2%【301。相反对Sinorhizobium和Bradyrhizobium在延滞期进行冻干，其存活率较高。研究表明：处于稳定期的细胞或成熟的孢子对不良环境具有较强的抗性，因而，保藏非芽孢细菌、酵母菌，应采用对数末期或稳定初期的细胞；而保藏芽孢细菌、放线菌和霉菌，要用成熟的孢子。培养基的影响尽管冻干保护介质是研究的重点,但乳酸菌的

29、生长因素也是一个重要的参数。培养基的组成对乳酸菌冻干后的存活率起着重要作用,主要表现在以下几个方面,如相容性溶质的积累涉及到糖类和渗透压及其他一些因素）、胞外多糖的产生和细胞膜上脂肪酸组成成分的改变。实践证明，由于各类食品微生物菌种之间生物学特性存在较大差异，要对其进行冻干保藏，往往需根据菌种的特性对冻干培养基进行优化，提高微生物细胞的存活率，延长菌种保藏期；如Huang等在对L.bulgaricus进行冻干保藏时，在保护培养基中加入山梨醇、脱脂乳等抗冻剂，细胞存活率提高到了86.53%。CaWamo等的研究表明，选择不同的生长培养基对保藏菌种的存活率也有重要的影响，3lOLactobacil

30、lusbulgaricus菌株的生长培养基中加入甘露糖时，其经冻干后细胞存活率比加入果糖，乳糖以及葡萄糖要高，同时也显示了在培养基中添加4种碳水化合物，均可以提高对冻干菌株的保护作用【321。但同一菌种在相同成分的培养基中培养，其为液体或固体培养对微生物的存活率影响不大。4.4冻结速度在真空冷冻干燥保藏菌种的过程中，冻结速度是影响微生物存活率的重要因素，不同微生物最佳冷冻速度不同，其主要原因是冻结速度必须与微生物细胞对水分的渗透率相平衡，而细胞对水分的渗透率取决于细胞表面积与体积的比率以及细胞膜的渗透率。当冷冻速度过慢时，细胞严重脱水，细胞体积严重收缩，超过一定程度时细胞将失去活性。同时冷冻速

31、度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度过高，产生溶质损害；当冷冻速度过快时，细胞内的水分来不及外渗，会形成较大冰晶，使细胞膜及细胞器遭到破坏，造成细胞内冰晶机械损伤。另也有研究报道，冷冻速度在5。C/rain.180。Cmin之间时，冷冻过程中胞内水分会完全渗出细胞，胞内不会出现结晶，细胞存活率较高；当冷冻速度大于5000。C/min时，胞内水分迅速形成结晶，不发生外渗，细胞存活率也比较高；但是如果冷冻速度在180。C/min.5000。C/min之间时，细胞内水分容易在外渗过程中形成结晶对细胞造成机械损伤。但是也有人认为真核微生物菌种适宜慢速冻结；而原核微生物

32、菌种经慢速冻结和快速冻结后，细胞存活率差异并不显著。4.5保护剂保护剂对于微生物菌株冷冻干燥保藏的存活率有较大的影响，选择得当的保护剂是提高微生物冷冻干燥保藏存活率、延长菌种保藏期的关键因素。保护剂可分为小分子保护剂（如低聚糖类、醇类、缓冲盐类、氨基酸和维生素类）和大分子保护剂（如蛋白质，多肽类和多糖类）。作为小分子保护剂，一般具有很强的亲水性，分子结构含有3个以上氢键，在冷冻或干燥过程中，可与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或菌体蛋白质极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性。而大分子保护剂通过“包裹”形式保护菌体，同时，促进低分子保护剂发挥作用。保护剂类型的选择主要取决于菌株的生物

33、学特性，如海藻糖对乳酸菌的冻干保藏效果显著。但也有一些保护剂可以用于多种微生物，如脱脂牛乳、血清、甘油、甜菜碱、阿东糖、蔗糖、葡萄糖和乳糖等.很多研究表明利用海藻糖作为冷冻保护剂可以使微生物的存活率比蔗糖更高，其中一个重要原因是海藻糖的玻璃化温度（即由玻璃态变为高弹态所需温度）较高，而玻璃化温度越高，冻干物在温度升高时更容易保持稳定。由于蛋白的玻璃化温度相对更高，所以其稳定性较糖类更好，因此蛋白在菌种保藏中的作用比糖类更重要。另外，对于经常需要反复冻融的样品，加入甘油有助于保持细胞活力。4.6复活处理保藏的菌种在使用时往往需要复活处理。对于液氮冷冻状态的菌种，通常采用38C-40C水浴快速升温

34、解冻，因为慢速升温解冻有可能造成胞内冰晶增大而损伤细胞。对于真空干燥和冻干菌种复活培养时，复水介质产生的渗透压和复水条件（温度、pH）都有可能对细胞膜以及酶蛋白分子的结构和性质产生影响，造成细胞损伤死亡。因此，一般采用最适该菌株生长的培养液或生理盐水并在适合其培养的温度下进行复水。研究表明，冻干固定化胚芽乳杆菌在pH4.5的无菌水中活化后，菌株的存活率接近100，游离胚芽乳杆菌菌株的存活率为75左右。其原因可能是在复水处理的过程中复水溶液的流速及用量对微生物细胞存在渗透冲击。乍用，固定化微生物细胞因受同定化材料的保护而几乎不受复水溶液的渗透冲击作用，其存活率明显高于游离微生物细胞。乳酸菌首先是

35、一种细菌其次它是一种有益细菌；农业部批准使用的菌株有16种，其中乳酸菌占11种，占6&75%；乳杆菌5种分别是：嗜酸乳杆瓠干酪乳杆亂乳酸乳杆菌植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌；肠球菌3种分别是：粪肠球瓠屎肠球菌、乳酸肠球菌，片球菌2种分别是：乳酸片球菌*戊糖片球菌；双歧杆菌1种是：两歧双歧杆菌；其中动物肠道原籍型乳酸菌：粪肠球亂屎肠球苗双歧乳杆菌、乳酸肠球菌特点一：特别是原籍乳醱菌如强徴乳酸粪肠球菌，在肠黏膜中有固定的定植点，可形成乳酸菌屏障，抵御外来抗原（病菌病毒及霉菌毒素、大豆抗原及其他）韵副影响口图示：（有专门的隐窝定植点）；而芽胞杆菌和酵母菌等是过路菌，没有这个功能G乳皱菌不仅可定植，而且可

36、以在定植点繁殖，这也决定了乳酸菌的使用剂量槻小。乳酸粪肠球菌嗜酸乳杆菌特点二：在政府政策上，乳酸菌占据重要的地位；农业部1126号公告公布的允许使用的16种饲用微生物菌株中就有11种是乳酸菌类，占6875%的比例；原籍乳酸菌有：双岐乳杆菌、乳酸粪肠球菌、屎肠球菌*乳酸肠球菌等特点三：在参考人类直接食用的微生物制剂中，几乎均为乳酸菌制剂特点四：无论从食用安全性上，或在动物体内厌氧环境中繁殖速度上讲）乳酸菌都是无可争辩的主角菌，其中又以乳酸粪肠球菌繁殖速度最快，达到20分钟一代，与大肠杆菌的19分钟一代相似，是唯一可以与大肠杆菌抗衡的乳酸菌菌株特点五：只有乳酸菌可在肠道中产大量的乳酸，起到酸化肠道的作用，并以此抑制大肠杆菌等有害細菌，以及提高和激活消化酶的活性，特别对仔猪肠道有益J因为仔猪肠道往往酸化不足；其中强微乳酸粪肠球菌分泌的乳酸为-型乳酸这是一种活性乳酸，可以直接利用，并缓解应激反应。特