板栗群体基因频率的研究

1、板栗群体基因频率的研究论文导读:：拓展荧光SSR技术的应用范围。进行多重PCR扩增。板栗群体中含有生态适应性的基因资源。建立群体混和样本中基因频率的分析方法。群体中单株再分别进行基因频率鉴定。论文关键词：SSR，多重PCR，板栗群体，混和样本，基因频率中国板栗Castanea mollissima是我国特有的壳斗科栗属植物。由于具有坚果品质好、抗逆性强等优点，中国板栗是世界食用栗品种改进的重要基因来源。板栗群体中含有生态适应性的基因资源，是丰富的基因库，对群体的遗传多样性和基因频率分析将为这些材料的利用、进化及其野生近缘种的关系等研究奠定根底。每个板栗群体单株混和取样可以较全面地分析群体内的等

2、位基因数、等位基因频率、遗传结构与稀有基因；群体遗传多样性分析的群体数目往往较多，群体中单株再分别进行基因频率鉴定，工作量大；而且，群体中的单株也大多是杂合状态SSR，对单株分别进行等位基因鉴定，也未必准确进行基因频率分析。因此，有必要建立一种可以基于混和取样的分析基因频率的方法，以提高分析效率与准确性。探讨板栗群体遗传多样性分析的取样策略，建立群体混和样本中基因频率的分析方法，是提高分析效率的有效途径论文下载。本试验拟采用基于全自动DNA遗传分析仪的SSR荧光标记检测技术，用6-FAM、HEX和NED等荧光染料标记引物，精确分析扩增产物的片段大小和定量扩增终产物丰度。利用ABI全自动遗传分析

3、仪获得混和样本SSR扩增产物丰度数据，用GeneScan与Genotyper软件进行图像、定量分析与数据输出，并探索使用R软件对Genotyper输出的信息进行混和样本等位基因频率分析，提高板栗群体基因频率分析效率与准确性，拓展荧光SSR技术的应用范围。1 材料与方法1.1 材料供试材料选用每个群体的采样株数为1421株表1。采样过程中，对于个体数大于20株的群体就按照均匀分布、随机取样的原那么进行采样SSR，而对于个体数少于此数的群体进行全部个体采样。本试验所用的普通引物由北京赛百盛基因技术合成，引物信息除无荧光标记外表2。SSR引物的5端分别用6-FAM、HEX和NED等进行荧光标记。表1

4、 板栗地方品种的来源与采样数Table 1 Origin and sample size oflandraces used in the study 群体编号Populations No. 名称name 地理来源Origin 采样数Sample size 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 西祥沟无花Xixianggou wuhua 新庙野板栗Xinmiao wild chestnut 辽丹58 Liaodan 58 大公书4号Dagongshu 4 东密坞无花Dongmiwu wuhua 燕昌Yanchang 炮车2号Paoche 2 处暑红C

5、hushuhong 官厅10号Guanting 10 柞红栗Zhahongli 燕红Yanhong 遵达栗Zundali 辽丹61Liaodan 61 菜西大油栗Laixi dayouli 大早熟Dazaoshu 短扎Duanzha 上丰Shangfeng 山东泰安Taian, Shandong 山东莒南Junan, Shandong 辽宁宽甸Kuandian, Liaoning 四川广元Guangyuan, Sichuan 河北迁安Qianan, Hebei 北京昌平Changping, Beijing 江苏新沂Xinyi, Jiangsu 江苏宜兴Yixing, Jiangsu 河北遵化Z

6、unhua, Hebei 陕西柞水Zhashui, Shanxi 北京昌平Changping, Beijing 河北遵化Zunhua, Hebei 辽宁宽甸Kuandian, Lioaning 山东莱西Laixi, Shandong 辽宁凤城Fengcheng, Liaoning 江苏宜兴Yixing, Jiangsu 山东烟台Yantai, Shandong 15 17 17 23 15 19 19 20 16 24 15 19 25 16 15 14 17 表2 本试验所用的SSR引物及荧光标记类型Table 2 The primers used in the studyand the f

7、luorescent labels 引物Primers 序列Sequence 退火温度 Optimal annealing temperature 荧光标记Fluorescent label CmTCR10 CmTCR21 CmTCR24 F CACTATTTTATCATGGACGG R CGAATTGAGAGTTCATACTC F CGAGGTTGTTGTTCATCATTAC R GATCTCAAGTCAAAAGGTGTC F CTGCAAGACAAGAATTACAC R GAATAACCTGCAGAAGGC 52 50 60 无Non NED 无Non HEX 无Non 6-FAM 1.2

8、 方法以采用混和取样法，从每个群体中选出15个单株，每个单株选取等质量叶片组成1 g混和样本，采用改进的CTAB法提取基因组总DNA。PCR扩增总反响体积为25 L，含2.5 L 10 x Buffer (100 mmol-L-1Tris-HCl, pH 8.3, 500 mmol-L-1KCl)，2.0 mmol-L-1 MgCl2，各引物0.5 mol-L-1，250 mol-L-1 dNTP，1 U Taq DNA 聚合酶和60 ng模板DNA，反响在热循环器MJ Research PTC 100中完成。扩增循环反响：94 5 min；94 50 s，各引物对退火温度45 sSSR，72

9、 90 s，30个循环；72延伸7min。不同引物选择适宜的退火温度。以新庙野板栗群体DNA为模板，选择退火温度相近的荧光引物CmTCR10和CmTCR21，进行多重PCR扩增，这两对引物检测通道的显色分别为蓝色与黑色。PCR体系和扩增程序除引物为两对外，其他的同常规PCR扩增一致。96孔板中，分别参加1 L 6-FAM、2 L NED、3 L HEX和22 L超纯水，5000 r/min离心1 min论文下载。于PCR仪上95变性5min，立即置于冰上。在ABI3700DNA分析仪上完成自动荧光检测。25 L PCR样品参加5 L 6xloading Buffer，混匀后，在95变性5min

10、，立即置于冰上。以pBR332/Msp片段为分子量标准。使用Seque-GenaGT电泳系统Bio-Rad, USA，90 W恒功率电泳约50 min1.0 h，在6聚丙烯酰胺凝胶PAGE上电泳。利用GeneScan和Genotyper软件进行图像分析与数据收集。用GeneScan扫描并分析SSR原始数据SSR，设置分子量内标Size Standard和参数Parameters，读取样品最顶峰，统计无峰样品，计算每板样品的通过率成功率，作为检验与纠正仪器电泳效果的依据。将无峰样品的比例控制在5%以内。Genotype软件的Categories、Analysis、Tables菜单中的相关选项对起

11、始片段大小、引物重复类型、域值、输出工程等参数进行设置，建立表格。利用R软件中的FREQS-R模块对Genotyper输出的信息进行分析，计算基因频率。2 结果与分析2.2 多重PCR以新庙野板栗群体的DNA样品为模板，荧光引物CmTCR10和CmTCR21为多重PCR的引物组合，扩增产物在ABI3700上进行检测，在分析数据或读带时，选择不同的显色通道，选择O：内标显红色，选择B：CmTCR10引物5端NED显蓝色，那么显示的图谱为红色内标峰和CmTCR10扩增产物不同等位基因的峰图2-A。引物CmTCR21扩增产物仅显示黑色的不同等位基因的峰与红色内标峰图2-B。图2-C为图2-A与2-B

12、的合成图谱SSR，结果显示，不同引物扩增产物的区分度良好论文下载。从Genotyper输出的数据中可提取片段大小、峰高等信息。在新庙野板栗群体中，多重PCR引物组合CmTCR10和CmTCR21的扩增产物区分度良好，没有形成干扰，CmTCR10能扩增出分子量分别为177、189、195、206和212 bp这5个等位基因，CmTCR21那么有152、158、167、175、184、189、201、209和215 bp共9个等位基因，两引物的等位基因片段所在区间重叠，根据不同的检测通道，分别读出各等位基因的峰高表3。峰高值与扩增终产物的丰度对应，直接与定量及频率换算相关。研究说明，荧光SSR分析

13、结合多重PCR技术能明确区分各等位基因片段和定量，用于分析板栗群体混和样本中等位基因频率确实是可行的。2.2 等位基因与基因频率的分析在17个供试群体中，引物CmTCR10NED共检测到78个等位基因，平均每个群体为4.6个；引物CmTCR24共检测到41个等位基因SSR，平均每个群体为2.4个。本试验CmTCR10常规引物扩增产物PAGE银染图谱中，仅在新庙野板栗群体中检测出4个等位基因图1，第2泳道；利用ABI全自动遗传分析仪对同一样本进行分析，可以清晰地检测出5个等位基因图2-A。同时可以在Genotyper中准确地输出片段大小及与扩增产物丰度相对应的峰高值表3。用Genotyper输出

14、数据，用R软件的FREQS-R模块，计算了西祥沟无花等9个群体CmTCR24及柞红栗等8个群体CmTCR10的混和取样等位基因频率表4。其中等位基因频率最小值为柞红栗的等位基因10199bp，频率为0.045。基因频率最高的为遵达栗的等位基因2179 bp，到达0.855。分析说明，通过对产物的定量分析，可以获得混和样本中各个等位基因的频率。图2 新庙野板栗群体荧光引物组合CmTCR10(NED)与CmTCR21(HEX)多重PCR产物在ABI3700 GeneScan检测图谱Fig.2 GeneScan profile of the multiplex PCR in xinmiaowild

15、chestnut with fluorescent primer CmTCR10(NED) and CmTCR21(HEX) in ABI3700DNA AnalyzerA: CmTCR10 (NED +ROX500), CmTCR10 (Blue NED + Red Size standard ROX500); B: CmTCR21 (HEX +ROX500), CmTCR21 (Black HEX + Red Size standard ROX500); C: CmTCR10 + CmTCR21 /M-CAT + 内标(复合图谱), CmTCR10+ CmTCR21 + Size stan

16、dard ROX500 (Multi-profile)表3 新庙野板栗群体多重PCR分析结果Table 3 Results from Genotyper data of multiplexPCR in xinmiao wild chestnut in ABI3700 DNA Analyzer 引物Primers 检测通道颜色Detection color 等位基因Alleles 片段大小Size /bp 峰高Peakheight CmTCR10 CmTCR21 分子量 内标 Molecular Size standard 蓝色Blue B 黑色Black HEX 红色Red O 1 2 3 4

17、 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 177 189 195 206 212 152 158 167 175 184 189 201 209 215 165 169 176 180 187 192 194 203 208 219 93 2316 655 146 4350 379 157 361 74 5348 66 943 97 1352 201 249 177 246 1452 61 734 2145 146 457 表4 板栗群体混和取样等位基因分布及其频率Table 4 The alleles and their frequencies we

18、re analyzedwith bulk sampling in chestnut populations 名称 Name 引物 Primer Allele 1 Allele 2 Allele 3 Allele 4 Allele 5 Allele 6 Allele 7 Allele 8 Allele 9 Allele 10 Allele 11 FS f FS f FS f FS f FS f FS f FS f FS f FS f FS f FS f 西祥沟无花Xixianggou wuhua 新庙野板栗Xinmiao wild chestnut 辽丹58 Liaodan 58 大公书4号Da

19、gongshu 4 东密坞无花Dongmiwu wuhua 燕昌Yanchang 炮车2号Paoche 2 处暑红Chushuhong 官厅10号Guanting 10 柞红栗Zhahongli 燕红Yanhong 遵达栗Zundali 辽丹61 Liaodan 61 菜西大油栗Laixi dayouli 大早熟Dazaoshu 短扎Duanzha 上丰Shangfeng CmTCR24 CmTCR10 - - 199 - - 199 - - - 176 - - - 176 - - - - - 0.535 - - 0.155 - - - 0.375 - - - 0.325 - - - 204

20、- - 204 - - - 204 - - - 179 - - - - - 0.375 - - 0.815 - - - 0.185 - - - 0.855 - - - - - - - - - 207 - 207 207 - - 181 - - - - 181 - - - - - 0.165 - 0.325 0.560 - - 0.525 - - - - 0.200 - 211 211 - - - - - - 211 - - - 182 - - - - 0.325 0.285 - - - - - - 0.275 - - - 0.525 - - - - - - - 212 - 212 - - -

21、185 - - - 185 - - - - - - 0.185 - 0.425 - - - 0.225 - - - 0.675 - - - 214 - - - - 214 - - - - - - - - 188 - 188 0.300 - - - - 0.420 - - - - - - - - 0.105 - 0.775 - - - - - - - 215 - - - - - - - 191 - - - - - - - - 0.255 - - - - - - - 0.800 - - 218 - - 218 - - - - 194 194 - - - 194 - - - 0.715 - - 0.

22、835 - - - - 0.355 0.085 - - - 0.605 - - - - 219 - - - 219 - - - - 195 195 - - - 195 - - 0.465 - - - 0.675 - - - - 0.145 0.475 - - - 0.225 - - - - - - - - 221 199 - - - - 199 - - - - - - - - - - 0.725 0.045 - - - - 0.290 - - - - - - - - - - - - 203 - - - - - - - - - - - - - - - - 0.390 - - - - - - FS

23、：片段大小Fragmentsize；f：等位基因频率Allelicfrequency；等位基因：Allele3 讨论本研究基于ABI全自动遗传分析仪ABI3700 DNA Analyzer的荧光SSR片段大小的分析技术有效地解决了上述问题。可以准确地读出每个等位基因片段的大小，有利于不同批次样品等位基因分析的数据统一；高度自动化与程序化，操作更为简便，省时省力论文下载。ABI3700或ABI3730毛细管型自动测序仪和与之匹配的软件直接进行程序化、数据化和图像化处理；可以精确定量扩增产物，该系统依据定量PCR原理SSR，对PCR产物乃至模板DNA中某一基因型进行定量分析。在等位基因频率、SSR定量分析方面有广阔的应用前景；效率更高，分析通量大。通过多重PC