2015研究生实验5-感受态与转化

1、2015研究生实验大肠杆菌感受态细胞的制备、重组DNA的转化、克隆筛选P1081. 实验目的和要求通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。2. 相关知识及原理感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。 转化（transformation）：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一

2、种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，如DH5a , DH10B。转化的方法：化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。克隆的筛选：主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；重组质粒克隆的鉴定Alpha

3、互补；核酸杂交；酶切鉴定；测序鉴定；PCR鉴定；免疫学方法；-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内互补（ -互补）。当这种载体转入可编码半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为-互补现象。由互补产生的半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5溴4氯3吲哚D半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列

4、之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ()基因的失活，破坏-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。互补的检测3仪器、材料和试剂无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心机，移液器，微型离心管等；菌株：E.coli DH5质粒：pBluscript KS+DNA 片段的质粒以及 pBluscript KS 空质粒；LB培养基；含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉素，浓度50-100gmL，X-gal 20-48g/ml, IPTG 100 g/ml。一般将抗生素、X-gal和IPTG配制成1000储备液，用时按培

5、养基的量再加入）；预冷CaCl2溶液（0.1molL） 4操作步骤 1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法) （1）从新活化的E.coli DH5菌平板上挑取一单菌落，接种于35ml LB液体培养中，37振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1:1001:50转接于100ml LB液体培养基中，37振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔2030min测一次OD600nm，至OD600nm0.5时停止培养；（2）每组取培养液1.5ml转入EP离心管中，在冰上冷却20-30min，于4，4000rmin离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；（3）倒

6、净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；（4）04，4000rmin离心10min；（5）弃去上清液，加入500l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。04，4000rmin离心10min；（6）弃去上清液，加入100l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；（7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70条件下，可保存半年至一年。2）细胞转化 (1) 取100l感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上

7、进行下面的操作)，加入1 l重组质粒DNA(体积不超过10l)+ 100l感受态细胞。(2) 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42水浴中保温90s，然后迅速冰上冷却2min(3) 立即向上述管中分别加入0.4ml LB液体培养基（不需在冰上操作），使总体积到0.5ml，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37振荡培养约45-60min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。3) 平板培养（有时需要稀释）取各样品培养液0.1ml，分别接种于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。(2) 菌液完全被培养

8、基吸收后，倒置培养皿，于37恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA产生5106-2107个转化菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。4)统计每个培养皿中的菌落数,检出转化体和计算转化率实验注意事项细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从-80甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600为0