#小白鼠卵母细胞体外成熟培养环境优化筛选

1、小白鼠卵母细胞体外成熟培养环境优化筛选哺乳动物体外受精研究已有一百余年的历史。早在1878 年, 澳大利亚科学家 Schek 就用兔进行过实验。 1935 年， Pincus 和 Enzmin 首 次观察到离开卵泡的兔卵母细胞可在没有促性腺激素的培养条件下自 动恢复和完成减数分裂 1 。自从他们发现有腔卵泡中的卵母细胞在体外培养可以自发成熟这一事实以来，人们在卵母细胞体外成熟方面做 了大量的工作，已成功地使多种哺乳动物的卵母细胞在体外成熟、受 精以及受精卵在体外继续发育 2 。1959 年张明觉成功使兔卵母细胞体 外受精并产仔， 获得世界首例的“试管动物” 试管兔。1965 年， Edward

2、s 通过研究小鼠、绵羊、牛、猪、猕猴和人的卵母细胞体外成 熟，发现卵母细胞离开卵泡环境后的自发核成熟是哺乳动物的普遍现象。1968 年，Wittingham 3 获得体外受精“试管小鼠”， 1982 年， Epping 4 等对小鼠腔前卵泡进行了体外成熟和体外受精研究， 并成功 产仔。 国内，陈秀兰等 5 于1986 年成功获得“试管小鼠”。 关于人的 卵母细胞体外受精的研究， Echwards 等在 1969 年就有过报道。 通过 几十年的不懈努力，卵母细胞的成熟系统已日趋完善，先后有30 多种哺乳动物的体外受精后代诞生 6 。在体外受精技术不断发展的过程中，卵母细胞的体外成熟始终被研究 者

3、所关注，卵母细胞在体外成熟的好坏直接会影响受精以及早期胚胎 的发育。因此 ,国内外学者对卵母细胞的体外成熟培养系统进行了大量 而卓有成效的研究。总之，卵母细胞体外成熟培养系统的建立是按照 仿生学的思路，如模拟卵巢液的成分和卵巢环境而逐步完善起来的， 使体外培养环境和母体体内相似，使体外培养的卵母细胞和体内成熟4的卵母细胞相同。最初使用的卵母细胞成熟培养基础液有 Tyrode 、Gey 、Earle 、Hanks 等盐类缓冲液，近年来多使用合成培养液如M199 、Ham s F10 和Ham s F12 ，而以 M199 使用最广泛。大量研究表明，以 TCM199 为卵母细胞体外成熟的基础培养液

4、，对牛、绵羊和猪的卵母细胞进行 体外成熟培养， 成熟率可达 80% 以上。 在基础培养液中添加其它成分可提高卵母细胞的体外成熟率。不同研究者目前常添加成分也不同。 一般都加 HCG 、PMSG 、FSH 、LH、E2等。促性腺激素能诱发卵丘 细胞扩展、增加达到 M 期的成熟率，并有促进卵裂的作用； FSH 可 以抑制颗粒细胞凋亡 , 维持颗粒细胞的成活力 ,进而维持颗粒细胞和卵 母细胞间的联系； 能够刺激卵丘细胞扩散 , 而扩散的卵丘细胞能够分泌 一种粘性的透明质酸 ,它有助于提高精子的活力。 FSH 、EGF 可以促进牛腔前卵泡颗粒细胞的增生和卵泡存活, 并使卵泡具备类固醇激素合成能力。添加

5、雌激素对卵母细胞体外成熟的影响，尚存在分歧。多 数学者认为雌二醇对卵母细胞完全成熟是有帮助的，雌二醇是促进胞 质成熟的重要成分 ,它能促进卵母细胞成熟分裂的复始 , 又能显著提高 卵母细胞的受精能力及早期胚胎的发育能力。可显著提高受精后胚胎 的发育率。但在添加发情牛血清、发情山羊血清时，雌二醇对卵母细胞体外成熟和胚胎发育并不重要。以添加发情牛血清取代促性腺激素 和雌激素， 同样可使牛卵母细胞成熟率达 90% 以上， 因而主张无激素 培养法 ,并也得到了较好的实验结果。 所得结论差异的原因可能是由于 成熟培养液中添加了未知大分子物质和激素 ,从而掩盖、 抑制或改变了 E2 的作用。许多研究证明在

6、牛的卵母细胞成熟培养液中添加LH（ 理想浓度 50ug/ml） 可使卵丘细胞利用葡萄糖生产丙酮酸的活性增加，促进三羧酸循环产生更多的 ATP，进而提高卵子的成熟度和受精后的发 育潜力。Chian 指出 ,在不含促性腺激素的成熟培养液中进行成熟培养 卵丘细胞的有无对卵母细胞后来的激活率无明显影响；但如果在成熟 培养液中加入促卵泡素 (FSH), 则卵丘细胞的存在显著抑制了卵母细 胞激活能力的获得 7 。这证明了卵丘细胞的作用受激素的调控 8 。然而，更多的研究者都在成熟液中添加血清白蛋白。血清白蛋白是血清中的大分子物质，具有很强的结合胆固醇和锌离子的能力，可除去 精子质膜中的部分胆固醇和锌离子，

7、 降低胆固醇在精子质膜中的比例， 进而改变精子质膜的稳定性，导致精子的获能。此外， BSA 还可使获 能精子迅速穿透卵子，对受精具有促进作用。研究表明， BSA 和丙酮 酸钠和乳酸钠同时使用可使鼠卵受精率高达 83-95% 9 。血清白蛋白 中使用最广泛的是牛血清白蛋白 （BSA ），由于 BSA 的作用时间较长，10且诱发精子获能的能力不强，故常作为辅助成分，但它对于卵母细胞 前期的培养也有一些影响，也有人通过添加牛血清白蛋白 (BSA) 来提 高卵母细胞体外成熟、 受精和早期胚胎发育率。 所以 BSA 广泛地使用 在的许多动物的体外细胞培养、体外获能和体外受精中。另外，成熟 培养液中也经常

8、添加血清。血清是一种含有多种已知和未知生物活性 成分的极为复杂的混合物，在卵母细胞体外成熟和受精中起着多方面11的重要作用。 在培养体系中添加血清能强烈地改变细胞功能 ,使颗粒膜 和膜细胞对卵母细胞减数分裂恢复的抑制失去效果 , 同时也能为卵母 细胞成熟提供所需蛋白质,能为卵丘卵母细胞复合体 (Cumulus Oocyte Complex ，COC )提供所需氮源，补充基础 培养液中没有或不足的营养以及必需的生长调节因子，从而促进卵丘 细胞层扩散和卵母细胞发育成熟。还能中和毒性物质保护细胞不受伤12害；对培养液的 PH 有缓冲作用 10 。卵母细胞成熟培养所用血清一般 为牛血清，常用的血清有胎

9、牛血清（ FCS）、发情牛血清（ OCS ）和 阉公牛血清（ SS）。Younis （ 1989 ）和 Schellander （1990 ）研究 证明 OCS 比 FCS 效果好 ,添加浓度 10% 为宜。目前，牛、羊卵母细 胞成 熟 培养 大都在 M199+10%ECS FSH LH+E2 中 培 养， 24-26h 后成熟率可达 80-90% 。13卵母细胞成熟是涉及核、质、膜、卵丘细胞和透明带等成熟的一个复 杂生物学过程 , 在形态上表现为纺锤体形成、 核仁致密化、 染色质高度 浓缩形成染色体；第一极体释放；细胞器重组；卵丘颗粒细胞扩展、 膨胀、液化和透明带软化等。近年来研究者借助光镜

10、和电镜逐渐揭示 出这一生理生化过程的形态结构变化 , 由于仅有核成熟和卵丘细胞成 熟能在光镜下进行判定 , 而对卵母细胞的综合成熟过程很难做一整体14的具有生理学意义的评价 11 。因而现在用于体外受精的主要是卵丘细 胞扩散的、并排出第一极体的卵母细胞。因此，动物卵母细胞在体外进行成熟培养要受到多种因素的影响。诸如动物种类异同、卵母细胞不同类型、获取卵母细胞的卵泡大小、成 熟培养时间、培养温度、培养液、生长因子、激素等。即使卵母细胞 在相同的培养体系中培养 , 其成熟率也会存在差异。 为了优化小鼠卵巢15卵母细胞体外成熟培养液，提高卵母细胞体外培养的成熟率；也为了 建立哺乳动物胚胎体外生产技术

11、体系，本试验以小鼠卵巢卵母细胞为 研究对象就其培养液对卵母细胞体外成熟的影响进行了研究，以探索 昆明小白鼠卵母细胞成熟发育的条件，优化选择培养液。1 实验材料和方法16实验材料实验动物昆明小白鼠，雌性，体重 20 30 ，来自天津医科大学实验中心。分 群饲养，自由采食专用颗粒饲料，自由饮水。实验用的主要仪器17CO2培养箱：型号2306 ，美国 SHELLAB 产品；超净工作台：型号AIR TECH, 苏宁集团安泰公司制造；实体显微镜：型号BO61 ，日本 OLYMPUS 制造；倒置显微镜：型号IX-71 ，日本 OLYMPUS 制造；18电子天平：型号 AW-220 ，日本岛津产品。实验用的

12、主要试剂M199 ：GIBICO 公司产品，批号： 20030522石蜡油： SIGMA 公司产品；批号： 2002061219FSH ：杭州日月动物药品有限公司产品，批号： 20040112 ；HCG ：杭州日月动物药品有限公司产品，批号： 20050226 ；FCS ：宁波市激素制造有限公司产品，批号： 20050226 ；丙酮酸钠： SIGMA 公司产品，批号： 20010301 ；20牛血清白蛋白： SIGMA 公司产品， 北京拜尔迪生物公司分装， 批号： 20030312 ；链霉素：河北远征药业股份有限公司生产，批号： 20051001 ；青霉素：河北远征药业股份有限公司生产，批号：

13、 20040616 。基础液211.1.4.1 基础液 I: M199 +NaHCO3 (0.22g/100ml)+青、链霉素(各 1 万 IU/100ml )。1.1.4.2 基础液 II: 改良的杜氏磷酸缓冲液（ mDPBS ），见表 1表 1 改良的杜氏磷酸缓冲液（ mDPBS ）配方22成分分子量分子式含量 （ mmol ）称量g ( / 100ml )NaCl58.44NaCl136.890.8KCl74.55KCl2.680.0223Na 2 HPO 4358.14Na 2HPO412H 2O8.090.290A液H2PO4136.09KH 2PO41.470.020葡萄糖180.

14、16C6H12O65.560.10024丙酮酸钠110.05C3H3O3Na0.330.036( g/ L)青霉素（IU/ml）100链霉素 （mg /ml）5025BSA3000B液CaCl 2110.99CaCl 20.900.0100.010C液MgCl 2203.31MgCl 2 6H0.490.0102O261.1.4.3 基础液 III ，TYH 液，见表 2。 .表 2 TYH 液配方含量 mmol称量( g/ 100ml )分子成分 分子式量27)NaCl58.44NaCl119.370.699KCl74.55KCl4.780.03628KH2PO4136.09KH2PO41.

15、190.016A液NaHCO 384.01NaHCO 325.070.211葡萄糖198C6H12O65.560.11029.17H2O丙酮酸钠110.05C3H3O3Na1.000.011青霉素（ IU/ ml ）10030链霉素（mg/ml）50BSA40.4B液MgSO 4246.47MgSO 4 7H2O1.190.02931C液CaCl 2128.99CaCl 2 7H2O0.120.0151.1.5 冲卵液：基础液 +5%FCS1.1.6 培养液：基础液 + FSH(1IU/ml) + HCG(2IU/ml)，在基础II 液，还加丙酮酸钠(0.11g/L )、丙酮酸钠(0.11g/

16、L )和FCS (10%)32或丙酮酸钠( 0.11g/L ) +BSA实验方法小鼠的处死及其卵母细胞的获取颈椎脱臼处死小鼠，取出卵巢，放入盛有冲卵液的大凹玻皿中，用异物针和 1mL 注射器在实体显微镜下刺破卵泡， 尽可能使卵母细胞充分33溢出。检卵用异物针在实体显微镜下把卵母细胞拨在一起， 并把卵母细胞分级 （A 级：四周有四层致密的卵丘细胞包裹； B 级：有部分的卵丘细胞； C 级：裸卵），然后用自制的玻璃吸管把不同的卵母细胞吸入相应的冲卵34液，洗涤 24 遍。培养在实体显微镜下，把卵母细胞移入盛有 500 L 培养液中，上面覆盖 石蜡油 400 L，然后倒罩一个小凹玻皿，置于 37 、

17、5%CO 2、饱和 湿度 CO2 培养箱中培养。35观察2h 观察一次卵母细胞的发育情况 (以生发泡破裂及第一极体排出为标 准)。一般 23h 后出现生发泡破裂 (GVBD) ，89h 开始排出第一极 体 (PBI) 。2 实验结果36成熟培养液对小鼠卵母细胞成熟发育的影响实 验 选 择 mDPBS 、 M199 或 TYH +FSH(1IU/ml) + HCG(2IU/ml) 作为卵母细胞成熟的培养液，就其对小鼠 C 级卵母细 胞的成熟发育的影响进行了研究。实验结果表明，培养在 mDPBS 中 的 C 级卵母细胞无论是生发泡破裂的比例 (GVBD % )还是第一极体 排出的比例(PBI% )

18、都明显高于培养在 M199 、TYH 中的 P0.05 ，37详见表 3表 3 不同的培养液中 C 级小鼠卵的体外成熟发育情况培养液GVBD %PBI %mDPBS19.8 ( 16/81 )12.3(10/81)38M19913.3(12/90)8.9(8/90)TYH12.3(10/81)7.4(6/81)培养液添加成分对小鼠卵母细胞成熟发育的影响从表 4可以看出，在培养基础液中加入添加物后，小鼠卵母细胞的成39熟发育效果明显见好（表 4 ）。单纯添加丙酮酸钠一种成分后，无论 GVBD % 还是 PBI% 都有明显提高（ P 0.05 ）；当添加丙酮酸钠 BSA 或丙酮酸钠和 FCS 时，

19、 GVBD % 和 PBI% 都有更大的提高，特 别在丙酮酸钠和 FCS 时， GVBD % 和 PBI% 分别达到 100% 和 86.2% ，取得良好的效果（ P0.01 ）。表 4 培养液添加成分对小鼠 C 级卵体外成熟发育的影响40培养液GVBD %PBI%mDPBS19.8(16/81)12.3(10/81)mDPBS+ 丙酮酸 钠42.9(36/84)23.8(20/84)41mDPBS+ 丙酮酸钠+BSA63.2(48/78)53.8(42/78)mDPBS+ 丙酮酸100钠+FCS( 153/153 )86.2(132/153)2.3 不同类型卵母细胞在 mDPBS 培养液中的

20、发育能力42实验也对 A、B、C 级卵母细胞在体外成熟培养中的发育能力进行了比 较研究。成熟培养液为 mDPBS+ 丙酮酸钠 +FCS 时，A、B、C 级卵 母细胞的 GVBD % 分别为 88.5% 、76.5% 和 100% ，PBI% 分别为 65.6% 、36.0% 和86.3% ， C 级卵母细胞明显优于 A、B 级卵母细 胞（ P0.05 ）。表 5 不同级别卵母细胞在 mDPBS 培养液中的发育能力43卵母细胞分类GVBD%PBI%A88.5(28/32)65.6(21/32)B76.5(38/50)36.0(18/50)44100(153/1C 86.3(132/153)53)

21、3 讨 论培养液对小鼠卵母细胞体外成熟的影响45小鼠卵母细胞成熟受诸多因素的影响，如动物个体差异、卵巢生理状 况及外界环境条件等，其中培养液是影响小鼠卵母细胞体外成熟的一 个重要因素。 在本实验过程中我们发现和 M199 、TYH 比较，mDPBS 液对小鼠裸卵的成熟培养效果较好。目前，多数资料报道用 M199 、 TYH 来培养小鼠卵母细胞，从本实验结果来看， mDPBS 作为培养液 则具有更好的成熟培养效果。当然，表 1 中三种培养液的成熟率都很46低，这可能是因为培养液中缺乏某种物质如丙酮酸钠和生长因子等所 致。培养液添加成分对小鼠卵母细胞体外成熟的影响丙酮酸钠作为一种胚胎早期发育的主要

22、能量代谢底物，它对卵母细胞的成熟起到举足轻重的作用，我们在实验中发现添加丙酮酸钠能显著47促进卵母细胞的成熟发育，从表 4 看，添加丙酮酸钠后卵母细胞的成 熟率由 12.3% 提高到 23.8% 。而用 mDPBS+ 丙酮酸钠 +BSA 或 mDPBS+ 丙酮酸钠 +FCS 组成的培养液来培养卵母细胞， 它的成熟效 果又高于 mDPBS+ 丙酮酸钠组成的培养液，这表明 BSA 和 FCS 对 卵母细胞的成熟又有促进作用。许多研究者在卵母细胞成熟培养液中 添加 BSA 和 FCS 来提高卵母细胞的体外成熟率， 据认为 BSA 和 FCS48对卵母细胞的早期发育有益处， 尤其添加 FCS 后，其效

23、果不仅明显优 于不添加蛋白组，而且明显优于添加 BSA 。和本试验结果相似，李朝 军等在进行体外受精研究时发现，在含血清的培养液中成熟卵母细胞 的，其体外受精率要高于在含 BSA 的培养液中成熟的卵母细胞 12 。 和 BSA 相比，血清除含有 BSA 外，还含有许多对细胞生长发育有益 的物质如生长因子、激素、维生素、抗氧化物等。49卵子类型对卵母细胞成熟发育的影响Eppig 等报道，裸卵的 GVBD 和 PBI 的发生率要高于 A 、B 级卵的GVBD 和 PBI 的发生率。和Eppig 等的报道相似，本实验裸卵的 GVBD发生率（ 100.0% ）也明显高于复合卵母细胞（ A 级 86.5

24、% ，B 级76.0% ），PBI 的排出率也明显较高（ C 级86.2% ， A、B 级分别为65.6% 和36.0% ）。而且和大多数研究相似，发现裸卵的 GVBD 和50排出 PBI 的时间较早。研究表明卵母细胞周围的颗粒细胞能分泌卵母 细胞成熟抑制因子（ OMI ）, 抑制卵母细胞的自发成熟 13 。在培养操 作过程中，由于机械性作用致使颗粒细胞脱落，从而解除了对卵母细 胞成熟的抑制， 使卵母细胞的成熟机制启动 14 ，从而大大的提高了裸 卵的成熟率。而在 A、 B 级卵中，由于卵丘细胞较多，卵母细胞和周 围的卵丘细胞和颗粒细胞的联系紧密，培养操作时不能使颗粒细胞脱51落，颗粒细胞分泌

25、的卵母细胞成熟抑制因子的作用不能解除，所以 A、B 级卵母细胞在体外成熟培养过程中成熟的少，成熟的速度慢。参考文献Vanderhyden BC,ArmstrongDT.Role of cumlus cells andserum on the in vitro maturation,fertilization andsubsequent52of rat oocytesJ.Biol Rep rod,1989,40(2): 720 -728.Schroeder A C. Epping JJ. The developmental capacity ofmouse oocytes that matured spontaneously in vitro is normalJ.Dev Biol,1984,10(2):493-497.Whittingham D.G.Fertillization of mouse gees in53vitroJ.Nature.1968，200 ： 592-593Epping JJ and AC Shroeder .Capacity ofmouse oocytesfrom preantral follicles to undergoembryogenesis and development to