夏橙类胡萝卜素合成关键酶基因（PSY、PDS和ZDS基因）的克隆及表达分析

1、夏橙类胡萝卜素合成关键酶基因PSY、PDS和ZDS基因的克隆及表达分析论文摘要：根据类胡萝卜素生物合成途径中的关键酶八氢番茄红素合成酶PSY、八氢番茄红素脱氢酶PDS和-胡萝卜素脱氢酶ZDSPSY、PDS和ZDS基因的氨基酸保守序列设计简并引物，利用RT-PCR技术分别从夏橙果皮中别离得到相应的三个cDNA片段，长度分别为：504bp、545bp和612bp；再根据得到的cDNA片段分别设计引物，利用 3RACE-PCR技术扩增得到各基因的3端，并并与之相应的片段进行拼接后分别得到PSY、PDS和ZDS基因的3末端全长。同源性分析说明，均与已报道的类胡萝卜素合成酶基因有不同程度的相似性。PSY

2、、PDS和ZDS基因在夏橙后期发育和成熟过程中的表达分析证明PSY、PDS和ZDS基因是夏橙果皮类胡萝卜素合成中的关键酶基因，对夏橙果皮色泽形成及调控有重要作用。论文关键词：夏橙,类胡萝卜素,克隆,基因表达植物中，类胡萝卜素在光合作用过程中起着重要的作用，它担当叶绿体光合天线的辅助色素，帮助叶绿素接收光能，另外它还能保护叶绿素免受破坏(Niyogi，1999)；近年来，众多的医学研究说明，类胡萝卜素能有效去除人体中多余的自由基，防止自由基对细胞的氧化，延缓衰老(Miki，1991)，在预防人类心血管和防癌抗癌BartleyandScolnik，1995；Giovannuccietal.,199

3、5)等方面也起着重要作用。但人体不能自身从头合成类胡萝卜素，必须依靠食物中类胡萝卜素的供给，而水果及蔬菜是获得类胡萝卜素的重要来源。夏橙ValenciaOrange)，亦称伏令夏橙,在广东广泛栽培,是一种适应性强的重要柑橘品种。由于要越冬，到次年的2月份以后产生返青现象，即果皮颜色局部变青，因而在采收时单个果实往往呈黄绿相间的斑驳状，从而影响其商品价值。柑橘果皮中类胡萝卜素的含量与组成是决定柑橘果实外观色泽的重要色素。在以番茄为模式植物对类胡萝卜素的生物合成及其代谢和调控进行了大量的研究，并已取得了一定的进展；编码控制类胡萝卜素合成的关键酶八氢番茄红素合成酶PSY、八氢番茄红素脱氢酶PDS和-

4、胡萝卜素脱氢酶ZDS的基因也相继研究，并已取得了一定的进展(Fraser,1994)；控制类胡萝卜素合成的关键酶基因PSY、PDS、ZDS也相继被别离。过去以甜橙和温州蜜柑为材在柑橘果实中类胡萝卜素的合成及调控的分子机理方面作了大量工作。但对夏橙发育及成熟过程中类胡萝卜素积累及分子调控的相关研究至今未见报道，本文克隆了夏橙类胡萝卜素合成过程中三个关键酶基因的3全长，为夏橙中进一步的类胡萝卜素合成调控及基因工程研究奠定根底。1.材料与方法：1.1材料供试材料为四会市龙圃镇柑橘试验园栽培的5年龄夏橙ValenciavalenciaLate)。取刚开始转黄的果实果皮用液氮速冻后于-80保存备提取总R

5、NA。1.2果皮总RNA的提取提取及别离方法为热硼酸法，根本参照Wan和Wilkins1994的方法。主要分为三个步骤：RNA抽提；RNA沉淀；RNA的回收及纯化。采用分光光度计测定总RNA的含量。评价RNA的完整性，取10ug总RNA进行1.2%琼脂糖变性胶电泳。1.3果皮总类胡萝卜素含量的测定取样品5克于10ml80%丙酮中避光浸提24小时，在紫外分光光度计下分别测量浸提液在440nm、645nm和663nm三个波长的吸光值，根据文献的公式计算出夏橙果皮总类胡萝卜素含量。1.43引物的设计及合成为获得PSY、PDS、ZDS基因的cDNA片段，根据GenBank登录的水果等其它物种PSY、P

6、DS、ZDS酶氨基酸保守序列设计合成三对简并引物，pPSY1-U：ATTCAGCCATTYMGAGAYATG，pPSY1-L：RAARTTGTTGTARTCATTSGC；pPDS1-U：CAAGRGATGTTCTWGGTGGA，pPDS1-L：RTTRCCATCYAARAAKGCCAT；pZDS1-U：RGGHCAYGAGGTGGATATA，pZDS1-L：ATDGGMCCACTCAARTAAAC采用RT-PCR技术扩增获得相应的cDNA片段。为获得PSY、PDS、ZDS基因的3全长，分别设计引物，PSY-3RACE：GTGTGACCGAGCTGAGTGAA；PDS-3RACE：AAGCAGG

7、GTGTACCTGATCG；ZDS-3RACE：GCGGATGCTCAAGGGTTC；为获得PSY、PDS、ZDS基因地高辛标记的探针。分别设计引物，PSY-DIG-U：GTGTGACCGAGCTGAGTGAA，PSY-DIG-L：CTGCTGATCAGAGCAAAGCA；PDS-DIG-U：GCCTTGGATTGTGAATTGGA，PDS-DIG-L：TATAAACCCTGCCTGCTCCA；ZDS-DIG-U：CCCCTTCAGACCTGATCAAA，ZDS-DIG-L：GAAGGGCGTTTAGATGTGGA。1.54RT-PCR扩增及序列分析PSY、PDS、ZDS基因的cDNA片段克隆

8、：以总RNA为模板，采用PrimeScriptRT-PCRKitTaKaRa试剂盒的试剂及说明方法。探针制备：将已确定序列的双链质粒DNA经过碱处理后，用地高辛DIG标记RNA探针试剂盒Roche分别合成带有DIG标记的探针。具体方法根据说明书。2.结果与分析：2.1总RNA的提取图1：夏橙果皮总RNA的甲醛变性胶电泳Fig.1TotalRNAseparatedonaagarose-formadehydeagarosegelinValenciaOrangepericarp2.2RT-PCR产物的扩增、拼接及序列同源性分析以果皮总RNA为模板，RT-PCR扩增结果显示，扩增的PSY、PDS和ZD

9、S基因产物的cDNA片段长度分别为：504bp、545bp和612bp，分别编码168、181和203个氨基酸与预期的扩增大小相一致。在NCBI中用BLASTP和BLASTX进行序列的同源性比对分析，发现所扩增的夏橙果皮PSY、PDS和ZDS基因cDNA片段与多种物种中相对应的同类基因cDNA序列高度同源。如夏橙PSYcDNA与葡萄柚ABY86652.1、番木瓜ABG72805.1、果梅BAF49052.1的PSY基因同源性分别为99%、92%和91%图2。PDS及ZDS基因cDNA片段序列比对也有相似的结果，与其它物种中相应的PDS和ZDScDNA的同源性均在90%以上图3和图4。推测克隆的

10、夏橙果皮PSY、PDS和ZDS基因cDNA序列编码夏橙类胡萝卜素合成途径中相应关键酶。挑出阳性克隆并测序后得到相应的序列，将测得的序列结果通过BLASTP或BLASTX搜索NCBI的核苷酸和蛋白质数据库，进行序列的相似性分析，发现与其它植物的同源性较高。以PSY片段为例，测序的结果翻译成氨基酸序列后，与番木瓜、葡萄柚及果梅进行序列比对DNAMAN软件，发现同源性达90%以上见图2。PDS及ZDS基因片段也有类似的结果图2-3和图2-4。进行利用RACR-PCR技术，分别扩增得到PSY、PDS、ZDS基因3末端，琼脂糖凝胶电泳后得到长度分别约为500bp、1kb和1.2kb的片段；然后据引物设计

11、位置及序列，把得到的3RACE-PCR产物与相应的片段进行拼接后，就得到相应的PSY、PDS、ZDS基因3全长；找出翻译区的终止密码子的位置，然后分别设计引物扩增出包含有翻译区及非翻译区的长度约为300bp-500bp的探针片段，并进行DIG标记。1IQPFIDMIEGMRMDLRKSRYKNFDELYLYCYYVAGTVGLMSVPIMGIAPESQATTESVYN2IQPFRDMIEGMRMDLRKSRYKNFDELYLYCYYVAGTVGLMSVPVMGIAPDSQATTESVYN3IQPFKDMIEGMRMDLRKSIYQNFDELYLYCYYVAGTVGLMSVPVMGISPESQA

12、TTESVYNXIQPFRDMIEGMRMDLRKSRYKNFDELYLYCYYVAGTVGLMSVPVMGIAPDSQATTESVYN1AALALGIANQLTNILRDVGEDARRGRIYLPQDELAQAGLSDDDIFAGTVTDKWRNFMKKQ2AALALGIANQLTNILRDVGEDAPRGRVYLPQDELAQAGLSDDDIFAGEVTIKWRNFMKNQ3AALALGIANQLTNILRDVGEDARRGRIYLPQDELAQAGLSDSDIYAGKVTDKWRSFMKNQXAALALGIANQLTNILRDVGEDAQRGRVYLPQDELAQAGLSDDDIFAGE

13、VTNKWRNFMKNQ1IKRARMFFDEAEKGVTELSAASRWPVWASLLLYRKILDEIEANDYNNFTKRAYVSKAKKI2IKRARMFFDMAENGVTELSEASRWPVWASLLLYRQILDEIEANDYNNFTKRACVSKAKKI3IKRARMFFDEAEKGVTELSEASRWPVWASLLLYRQILDEIEANDYNNFTRRAYVSKAKKLXIKRARMFFDMAENGVTELSEASRWPVWASLLLYRQILDEIEANDYNNF-*.*图22-1夏橙：PSY基因片段的序列比对的结果1,：番木瓜ABG72805.1);，2,：葡萄柚ABY8

14、6652.1);，3,：果梅BAF49052.1);，X,x：夏橙PSY测序结果.Fig.2：TheresultsofmultiplesequencealigmentonPSYgeneamplifiedfromValenciaOrangepericarp1,：Caricapapaya;，2,：Citrusparadisi;，3,：Prunusmume;，X,xPSY：deducesequencesequenceofValenciaorange.1ADAGHKPLLLEARDVLGGKVAAWKDDDGDWYETGLHIFFGAYPNMQNLFGELGINDRLQW2ADAGHKPILLEARD

15、VLGGKVAAWKDKDGDWYETGLHILFGAYPNIQNLFGELGIDDRLQW3ADAGHKPLLLEARDVLGGKIAAWKDGDGDWYETGLHIFFGAYPNIQNLFGELGINDRLQWx-RDVLGGKIAAWKDGDGDWYETGLHIFFGAYPNIQNLFGELGINDRLQW1KEHSMIFAMPNKPGEFSRFDFLEELPAPLNGIWAILKNNEMLTWPEKVKFAIGLLPAMVG2KEHSMIFAMPNKPGEFSRFDFPEVLPAPLNGIWAILKNNEMLTWPEKIKFAIGLLPAILG3KEYSMIFAMPNKPGEFSRFD

16、FPEVLPAPLNGILAILRNNEMLTWPEKVKFAIGLLPAIIGxKEHSMIFAMPNKPGEFSRFDFPEVLPAPLNGILAILRNNEMLTWPEKVKFAIGLLPAIIG1GQEYVEAQDGLSVQEWMRKQGIPDRVTNEVFIAMSKALNFINPDELSMQCILIALNRFLQ2GQAYVEAQDGLSVKDWMRKQGIPDRVTTEVFIAMSKALNFINPDELSMQCILIALNRFLQ3GQAYVEAQDGLTVQEWMRKQGVPDRVTTEVFIAMSKALNFINPDELSMQCILIALNRFLQxGQAYVEAQDGLTVQE

17、WMRKQGVPDRVTTEVFIAMSKALNFINPDELSMQCILIALNRFLQ1EKHGS-2EKHGSKMAFLDGSPPERLCAPIVDHIQSLGGEVRINSRIQKIELNKDGTVKSFVLNNGSM3EKHGSKMAFLDGNPPERLCLPIVEHIQSLGGEVRLNSRVQKIELNDDGTVKNFLLTNGNVxEKHGSKMAFLDGN-*图32-2夏橙：PDS基因片段的序列比对的结果1,：番木瓜ABG77271.1);，2,：杏AAX33347.1);，3,：葡萄柚AAK5145.1);，X,x：夏橙PDS测序结果.Fig.2：Theresultsofm

18、ultiplesequencealigmentonPDSgeneamplifiedfromValenciaOrangepericarp1,：Caricapapaya;，2,：Prunusarmeniaca;，3,：Citrusparadisi;，X,x：deducesequencePDSsequenceofValenciaOrange.1-LDQGHEVDIYDCRSFIGGKVGSFVDKRGNHIEMGLHVFFGC2LKVAIIGAGLAGMSTAVELLDQGHEVDIYESRSFIGGKVGSFVDKRGNHIEMGLHVFFGC3-ELLDQGHEVDIYESHSFIGGKVGSF

19、VDKRGNHIGMGLHVFFGCx-GHEVDIYELRSFIGGKVASFVGKRGNHIEMGLHVFFGC*.*1YNNLFRLMKKVGADKNLLVKDHTHTFVNEGGEIGELDFRFPIGAPLHGIRAFLATNQLKT2YNNLFRLMKKVGADKNLLVKDHTHTFVNQGGEIGELDFRFPIGAPLHGIRAFLSTNQLKT3YNNLFRLMKKVGADKNLLVKDHTHTFVNKGGEIGELDFRFPVGAPLHGINAFLSTNQLKIxYNNLFRLMKKVGADKNLLVKDHTHTFVNQGGEIGELDFRFPIGAPLHGIRAFLST

20、NQLKT1YDKARNALALALSPVVKALVDPDGAMVDIRNLDSISFSDWFISKGGTRTSIQRMWDPVAY2YDKARNALALALSPVVKALVDPDGALKDIRDLDSISFSDWFLSKGGTRTSIQRMWDPVAY3YDKARNAVALALGPVVRALVDPDGALREIRDLDRISFSDWFLSKGGTRASIQR-xYDKARNALALALSPVVKALVDPDGALKDIRDLDSISFSDWFLSKGGTQTSIQRMWDPVAY1ALGFIDCDNISARCMLTIFSLFATKTEASLLRMLKGSPDVYLSGPIKKYIIDRGGR

21、FHLR2ALGFIDCDNISARCMLTIFALFATKTEASLLRMLKGSPDVYLSGPIRKYITDKGGRFHLR3-xALGFIDCDNISARCMLTIFALFATKTEASLLRMLKGSPDVYLSGP-图4夏橙2-3：ZDS基因片段的序列比对的结果1,：番木瓜ABG72806.1);，2,：蜜柑ABC33728.1);，3,：咖啡ABC87740.1);，Xx,夏橙：ZDS测序结果Fig.24：TheresultsofmultiplesequencealigmentonZDSgeneamplifiedfromValenciaOrangepericarp1,：Caric

22、apapaya;，2,：Citrusunshiu;，3,：Coffeacanephora;，X,xZDS：deducessequenceofValenciaOrange.2.3夏橙PSY、PDS、ZDS基因在NorthernBlotting检测夏橙后期发育进程发育进程在PSY、PDS、ZDS基因在果皮中的表达分别以克隆的PSY、PDS、ZDS基因3末端全长为模板，设计特定引物，获得PSY、PDS、ZDS地高辛标记的探针，用于检测3个基因在夏橙发育后期7个阶段P1-P7果皮中的表达状况。从P1至P4，果实颜色逐渐转黄，P4期果实呈最明亮黄色。P4之后果皮开始出现不同程度的返青现象(图5B彩图。类

23、胡萝卜素总量的变化为P1期最低，之后呈显著上升趋势，到P4期含量最高，达84.4ugg，之后类胡萝卜素总量又下降,至P7期最低(图5A。P1至P7的发育进程中相应基因的表达变化为：PSY基因在P1-P3表达较弱，在果实成熟转黄的P4及P5期增强，在夏橙果实发育后期P6和P7PSY基因表达又减弱；PDS基因在检测的各个阶段均有表达，但在果皮呈黄色的P4和P5阶段表达最高；ZDS基因在P1至P3期表达极弱，P4期显著增强，P5期又有所降低，之后没有检测到表达图5B。 跟踪观察夏橙果实后期的生长发育过程及果皮外观的颜色变化，将夏橙果实的后期生长发育过程分为7个时期。P1至P7的发育过程中，类胡萝卜素

24、合成途径中PSY、PDS、ZDS基因表达的变化为图3：PSY基因在P1至P3期表达较弱，P4及P5期增强，之后又减弱；PDS基因在果实后期发育的各个时期均有表达，其中P4和P5期的表达最高；ZDS基因在P1至P3期表达极弱，P4期显著增强，P5期有所降低，之后没有检测到表达。图35夏橙果实后期发育进程过程中果皮类胡萝卜素总量A)及果皮PSY、PDS、ZDS基因表达(B的的变化Fig.35ChangesoftotalcarotenoidsandPSY、PDS、ZDSgeneexpressioninpericarpinduringthelatedevelopmentalstagesofValenc

25、iaOrangepericarpduringfruitdevelopment3.讨论：在夏橙果实后期生长发育及成熟过程中，果皮颜色发生着由青到黄然后又返青的变化，类胡萝卜素总量的变化趋势与果皮颜色的变化一致，说明果皮中类胡萝卜素的含量决定了夏橙的果皮颜色。这一结果也证明了类胡萝卜素的含量与组成直接决定柑桔成熟果实的色泽，从而影响果实的商品性。前人研究结果说明植物体内类胡萝卜素生物合成的调控点位于类胡萝卜素生物合成相关基因的转录水平上，其中PSY、PDS、ZDS基因分别编码类胡萝卜素生物合成途径中的八氢番茄红素合成酶PSY、八氢番茄红素脱氢酶PDS和-胡萝卜素脱氢酶ZDS，调控植物体内类胡萝卜素

26、生物合成的关键限速反响。本文克隆了夏橙类胡萝卜素合成过程中三个关键酶基因的3末端全长，序列分析说明夏橙果皮PSY、PDS和ZDS基因cDNA片段与多种物种中相对应的同类基因cDNA序列高度同源，因此推测克隆的PSY、PDS和ZDS基因可能参与调控夏橙果皮中类胡萝卜素的合成。在夏橙果皮呈最明亮黄色，类胡萝卜素含量最高的P4阶段，PSY、PDS、ZDS基因表达水平也最高，随着果皮返青现象的出现，类胡萝卜素总量和PSY、PDS、ZDS基因表达水平均降低，暗示夏橙果皮内类胡萝卜素的合成受PSY、PDS、ZDS基因表达的调控。另外，在P1-P3期，PSY和ZDS基因表达较弱，而PDS表达较强，这可能由于在果实类胡萝卜素积累水平到达最高之前，PDS基因表达对类胡萝卜素的合成起主导作用，这与柑橘果实类胡萝卜素的积累是PSY、PDS和ZDS等基因协同表达的结果相一致。另外，夏橙中PSY、PDS、ZDS基因3末端全长的克隆，为从分子水平上进一步说明柑橘果实外观色泽的形成机理及用遗传工程技术实现柑橘果实外观色泽的调控奠定根底，对丰富植物体内类胡萝卜素生物合成的机理研究也有重要的理论意义。首次别离出类胡萝卜素生物合成基因是从荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)中Ar