生物实验实时定量PCR实验报告

1、精品文档实验四 定量 PCR 扩增姓名：李宗翰专业：环境工程学号： 1432999 同组人姓名：刘雪飞一、实验目的复习定量PCR 原理，熟悉绝对定量的操作流程二、实验原理实时荧光定量PCR 是在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过Ct 值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析三、实验仪器及材料real time PCR仪（ABI7500, RotorGene 3000）,微量移液器，Tip 头，0.2ml 光学薄 壁管，8联PCR管，1.5

2、ml离心管，SYBR Mix,引物及108 copy/ul标准品 四、实验步骤1、标准样品稀释：取4 个 1.5ml 的离心管，写上标记107，106, 105, 104，向每管加入90仙l ddH2O,取10屋108 copy/ul的标样加入到107管中，充分混匀 后，从管中取10履107 copy/ul的液体到106管中。按上述操作依次稀释，得到 5 个倍数的标准样品。注意，每次稀释都要换Tip 头。2、配制预混液：取119仙l ddH2。、7屋引物4204f、7川弓I物4448r和7仙l Rox 到装有175仙l SYBR Mix液的1.5ml离心管中，混匀。3、分装预混液：取7 个小离

3、心管，分别标记108、 107、 106、105、 104、 UNK（未知样）、NTC （阴性对照）。向其中分别加入42履预混液和4.7仙l模板（1-5 号加标样、6 号加未知样、7 号加等量ddH2O） ，混匀。4、戴上手套取两个8联管，并排放置管架上。分别取上述样品20履至第1-7管中 （第 8 管空出） ， 每个样品两个重复，共 14 个样品。 将加好样的8 联管振荡。5、设置分析仪参数如下：95 C 3min； 95 C 15s+60c 40s为一个循环，循环次 数40,融解曲线温度范围6095C。振荡好的卞品进机进行 PCR扩增。6、扩增后利用软件分析Ct值及未知样的定量结果。精品文

4、档五、实验结果与讨论1、实验结果如何？试分析答：实验结果及分析如下。WellA1A2B1B2C1C2D1D2E1E2F1F2G1G2(1)、实验具体数据见卜表QuantityCtTaskCtCt MeanCt SDQuantityMeanQuantity SDThresholdSTANDARD8.24888.25270.00551000000000.0712STANDARD8.25658.25270.00551000000000.0712STANDARD11.389311.65980.3825100000000.0712STANDARD11.930311.65980.3825100000000

5、.0712STANDARD15.329214.96680.512610000000.0712STANDARD14.604314.96680.512610000000.0712STANDARD19.491219.30800.25901000000.0712STANDARD19.124919.30800.25901000000.0712STANDARD22.538522.41960.1681100000.0712STANDARD22.300722.41960.1681100000.0712UNKNOWN8.93708.96910.045459501332583025841695285.6250.0

6、712UNKNOWN9.00128.96910.045457103836583025841695285.6250.0712NTC32.53290.0712NTC32.95490.0712其中，A-E为标准样品，F为位置样品，G为阴性对照。每个样品做两个平行。通过软件分析，由标准曲线得到的未知样品的定量结果约为5.83X 107。(2)、扩增曲线*即I肥*lunPklQt。QQIOQ 1BIF B!II!VB1-IA 。且中3速访前我W点国里里N道Cdt 4 目立口wf ,后h从扩增曲线中可以看出，样品均经历了良好的扩增过程。精品文档tomIOKK1CKKKK：WEKKDQIKKDOQaIXXK

7、KDCiCD10CXEOC uanllMI Eluinduid Unknown UrikriDwrMF用sW)吁0 996 Eff% = 29 6MS从标准曲线中可以看出，R2值较好，标准曲线可以使用。但扩增效率一般。其(3)、标准曲线Standard Curvs中106和107的两个平行样的CT偏差较大，这一现象可以从(1)表中看出，其SD分别为0.5126和0.3825,相比其他点较大，一般认为 SD大于0.5不理想。(4)、融解曲线-?圭而图中，可以看出每条曲线均为单峰且在一个合理的温度范围内(8286C),所以扩增是正常的，不存在非特异性扩增。2、 实 验过程中需要注意些什么细节？答：

8、 （ 1） 、操作过程中尽量不要说话，以避免污染；、 用微量移液器加样品时应保证枪头深入液面以下，这样样品不会留在管壁上；、不能在定量PCR 管做标记，裸手不可以接触定量PCR 管，操作时应戴手套。、 8 联定量 PCR 管加完样后，可先将盖子放上，等放到振荡机上再把盖子盖紧。3、通过这个实验你有什么收获？这个实验对你今后开展相关实验研究是否有帮助？答：通过实验我加深了对定量 PCR的理论认识，熟悉了实时荧光定量 PCR的操 作流程。这一实验对我今后研究环境问题的微生物活动方面是有帮助的。六、思考题如果你自己的试验过程中，发现扩增效率是0.76、 1.52或 0.99, 实验结果能用吗？如果结果不能用，请说明原因，怎么样改变实验来解决这个问题？答：扩增效率的有效值分两个范围，宽范围在0.8-1.2之间，窄范围在0.9-1.1 之间。如题，若实验得到的扩增效率为0.76 或1.52，均在宽范围之外吗，则说明扩增不太理想，数据不能直接用。可以通过删除某些偏差较大的点来提高扩增效率